脐橙果皮褐变相基因CsCP和CsNAC的克隆与表达分析.pdf

Master’s Degree Dissertation of Chongqing University Molecular Cloning and Expression Pattern of CsCP and CsNAC from ‘Navel’ Orange Related to Citrus Peel Pitting Master’s Degree Candidate: Fan Jing Supervisor: Prof. Li Zhengguo Major: Crop Genetics and Breeding College of Bioengineering Chongqing University October 2007 摘 要 奉节脐橙(Citrus sinensis Osbeck)是一种优良的甜橙鲜食品种，是重庆市柑橘出 口中唯一具有较强竞争优势的品种。但是，其果皮容易发生褐变，主要症状为油 胞破裂下陷、形成褐斑，极大地影响了果实的感官品质和商品价值。目前，对脐 橙果皮褐变的诱发因素已有大量研究，但在分子机理研究方面尚十分缺乏。在本 实验室前期工作中运用抑制差减杂交方法构建了脐橙果皮褐变相关基因的 cDNA 差减文库。经序列分析表明，该文库中包括了蛋白质加工、能量代谢、转录调控、 胁迫反应等生化代谢途径的相关基因。 为了深入阐明果皮褐变相关基因对果皮褐变发生的作用，本研究从脐橙果皮 褐变差减文库中选择了两个感兴趣的 EST 序列 7 号和 27 号，分别为与衰老相关的 半胱氨酸蛋白酶同源基因和与胁迫相关的 NAC 转录因子同源基因。通过 RACE(Rapid Amplification of cDNA Ends)技术克隆得到其未知的 5’端或 3’端区域， 从而获得全长 cDNA 序列。7 号克隆全长 cDNA 序列为 1409 bp，命名为 CsCP， GenBank 登录号 EF690284 。CsCP 包含一个 1083 bp 的开放阅读框(ORF)，编码 361 个氨基酸，预测的蛋白质分子量为 39.38 kDa，等电点为 6.69 。其中 1-23 位氨基酸 残基为信号肽，该蛋白质定位在内质网上。CsCP 蛋白与 aleurain 半胱氨酸蛋白酶 的同源性高达 80% 以上。27 号克隆全长 cDNA 序列为 1203 bp，命名为 CsNAC， GenBank 登录号 EF596736 。CsNAC 包含一个 915 bp 的开放阅读框(ORF)，编码 305 个氨基酸，预测的蛋白质分子量为 35.2 kDa，等电点为 6.72 。CsNAC 蛋白具有高 度保守 N 端和高度可变的 C 端，与拟南芥中的 ATAF1 蛋白的同源性为 63%，同属 于 NAC 结构域蛋白 ATAF 家族。 运用荧光定量 PCR SYBR Green I 染料法分析了 CsCP 和 CsNAC 基因在果皮 褐变发生进程和不同组织中的表达模式。结果表明，伴随果皮褐变指数的上升， CsCP 基因的表达增强。由于柑橘果皮褐变也是一个衰老的过程，因此 CsCP 是一 个与果皮褐变及衰老相关的基因，在果皮褐变过程中受上调表达。CsNAC 基因在 柑橘果皮发生褐变的进程中，其表达水平比在正常果皮中高，说明它也是一个褐 变相关基因，可能在褐变的整个发展进程中发挥着重要作用。Northern 杂交结果表 明，CsCP 基因受低氧 3% O2 和高温 40 ℃诱导表达，而受损伤、乙烯处理和无氧 0% O2 抑制表达。说明 CsCP 是一个与胁迫反应相关的基因，而且它是目前发现的 第一个从柑橘中分离的受乙烯抑制表达的半胱氨酸蛋白酶基因。CsNAC 基因的表 达水平受损伤和无氧强烈诱导，而不受低氧影响，说明 CsNAC 不仅是一个损伤诱 导基因，而且也是一个无氧相关基因，可能在非生物胁迫条件引起的果皮褐变过 I 程中扮演重要角色。此外，CsNAC 也受到外源乙烯的诱导表达，说明它可能是