农杆菌及基因枪导的茶树外源基因导入体系优化研究.pdf

摘要 茶树(Camellia 的培育和推广，是科技在茶叶生产中发挥效益的重要体现。仅仅依靠传统的育种 方法已不能满足现代社会需求的迅猛发展。因而必须吸收和借鉴现代科学技术成 果，利用这些新的方法和手段．培育出更优秀的茶树品种。植物转基因技术作为 植物基因工程的一个重要组成部分，不仅为基因表达调控和遗传研究提供了一个 理想的实验体系，更为植物(尤其是农作物)的定向改良和分子育种提供了一个 有效的途径和方法。 本研究在前人的基础上，优化了茶树的遗传转化系统。主要内容如下 进一步调整了茶树常用的遗传转化体系一农杆菌体系。在用农杆菌浸染前， 将茶树外植体预培养在含有PVP([69／L)的预培养基上2-3d可提高转化频率。 但在预培养基中添加CaCl2反而使转化频率降低。 对基因枪介导的茶树转化体系的有关参数进行优化。比较了不同的预培养条 件，结果表明：AgN03对转化频率影响不大；此外，茶树外植体若在含有AgN03 于预培养时，得到的转化率最高。即使在没有AgN03和CaCl2的条件下，在愈 较好的转化效果。渗透处理不仅不能提高GUS的表达率，反而使愈伤再生困难。 1中加入1．6lal质粒 优化后的基因枪转化制弹程序为：60mg／ml钨粉悬浮液10u DNA(1 15ul，最后 u∥p1)，再分别加入0．1M的亚精胺4ul，2．5M的CaCl2 u 1．t 定容至48l；每次轰击上样量为8．10I。在轰击压力7MPa，射程5cm．真空 度．0．095MPa的条件下轰击一次，不论对GUS表达还是愈伤的再生部是较为适 合的轰击条件。基因枪转化后抗性筛选2个月，抗性愈伤组织存活率为5O％～ 12．】％。 比较了农杆菌法(AGR)，基因枪法(BOM)及农杆菌与基因枪结合(BTA， BPA和BOA)等方法对茶树遗传转化效率的影响。瞬间表达的结果及抗性愈伤 筛选的结果都显示，农杆菌与基因枪结合使用比两种方法单独使用更有助于提高 茶树转化的效率。 本实验中三个茶树品种～乌牛早、劲峰和紫笋得到的转化频率相似。根据本 实验的结果，品种对转化的影响．不存在于品种间细胞感受能力的差异：然而， 可能不同品种间再生能力的强弱是实验成败的另一个关键。 关键词：茶学：茶树(Camelliasinensis(L)0．Kuntze)；转化：农杆菌；基因枪 Ⅱ ABSTRACT Tea oneofthe plant(Camelliasmemis(L)O．Kuntze)ismost economic important inChina．Tobreedand plants the teacultivarsisa popularizeimproved very of scienceand toshowtheir importantaspect ontea technology power production． traditional call Nowadays，the methodsnotmeetthe demandofthe breeding great