农杆菌介导的次柿ACC合成酶与ACC氧化酶反义基因遗传转化研究.pdf

摘 要 本研究以次郎柿组培苗叶片为试验材料，首次对根癌农杆菌 EHA101 介导的 ACS 与 ACO 反义联合基因转化次郎柿进行研究。主要内容包括①研究了选择抗生素壮观霉素和抑 菌剂头孢霉素对叶片直接分化不定芽的影响。②建立了以次郎柿叶片为转化受体的根癌农 杆菌遗传转化体系，详细探讨了预培养时间、共培养时间、筛选培养时间、侵染菌液浓度、 AS 浓度等因素对于转化效率的影响，并优化了转化条件。③采用根癌农杆菌介导法，进行 了ACC 合成酶和ACC 氧化酶反义联合基因转化次郎柿的研究。④对筛选得到的抗性植株 叶片进行了PCR 检测。⑤研究了次郎柿嫁接条件。主要研究结果如下： 1．叶片外植体对壮观霉素非常敏感，在分化培养基中附加30mg/L 的壮观霉素即可完全抑 制不定芽的分化；头孢霉素对叶片外植体的分化没有严重影响，300mg/L 头孢霉素就能较 好的抑制农杆菌的生长，且不定芽诱导率可达到72.4% 。 2. 选择预培养4d 的叶片，用菌液OD600 值为0.6 的菌液侵染10min，侵染时加入200 mg/L 的乙酰丁香酮，转到DKW （1/2N）+ ZT 1.0 mg/L+ TDZ 0.5 mg/L+Cef 300 mg/L 的培养基上 共培养3d，再通过延迟筛选3d，可获得较好的转化效果，叶片分化率最高可达66 % 。 3. 通过建立的遗传转化体系，获得抗性苗320 株，其中38 株经PCR 检测呈阳性。 4. 嫁接时采用用磨尖的镊子在留有 3~5 片叶片的砧木上面戳一个深约 3~5mm 的孔，然后 把下端表皮刮出伤口的接穗插入砧木上的孔里面，接穗大小为 6mm 左右时成活率最高。 关键词：次郎柿；ACC 氧化酶；ACC 合成酶；转基因 Transformation of antisense ACC synthase and ACC Oxidase in‘Jiro ’persimmon Author ：Liu Yongju Major ：Primary product processing and storage engineering Supervisor：Ma Junlian ProfessorZhang Zide Professor Abstract In this study, Jiro persimmon in vitro plantlet leaves were used for test materials. The first time, Agrobacterium tumefaciens EHA101-mediated ACO and ACS antisense gene transformation into Jiro persimmon was studied.The study include the effects of selection antibiotics Spc and antibacterial agents Cef on direct differentiation of adventitious buds; A genetic transformation system was established using Jiro Persimmon leaves as receptors, such factors that impacted the conversion as pre-culture time, co-culture time, de-culture time, Agrobacterium tumefaciens concentration for infection and AS concentration were detailedly discussed, and the conversion conditions were optimized; Agrobacterium