第五章其他分离方法.pptVIP

一、纸层析分离过程 二、操作技术 2.展开剂 3. 点样 4.显色、检测 三、特点及应用 柱层析 柱层析：是吸附色谱的一种，它利用吸附剂对不同物质吸附能力的差异，用溶剂将混合物的组分逐一洗脱分离的一种分离方法。 微型柱层析实验 实例: 凝胶过滤层析纯化细胞色素C 一、目的要求 1.学习和掌握凝胶过滤层析分离蛋白质的原理与方法。 2.通过凝胶过滤柱层析对细胞色素C进行纯化 二、原理 凝胶过滤层析也称分子筛层析、排阻层析。是利用具有网状结构的凝胶的分子筛作用，根据被分离物质的分子大小不同来进行分离。 优点： a. 条件温和 b.操作简便 c. 损失少回收率高 d. 层析柱可反复使用 凝胶的类型： Sephadex: 交联葡聚糖 Sepharose：琼脂糖凝胶 Bio-Gel A Bio-Gel P：聚丙烯酰胺凝胶分子筛 Sephacryl：用N，N-亚甲双丙烯酰胺交联的葡聚糖凝胶 凝胶及柱的选择 样品上柱 分析用量：柱床体积的1—2% 制备用量：柱床体积的20—30% 洗脱收集 部分收集器、核酸蛋白检测仪 凝胶的保存方法 0.02%叠氮钠或0.002%洗必泰 三、试剂与器材 试剂：0.01mol/l Tris-HCl缓冲液，PH7.5，含0.2mol/l NaCl 器材：层析柱、部分收集器、核酸蛋白质检测仪 、记录仪 （二）装柱 1.装柱前，必须用真空干燥器抽尽凝胶中空气，并将凝胶上面过多的溶液倾出。 2.先关闭层析柱出水口，向柱管内加入约1/3柱容积的洗脱液，然后边搅拌，边将薄浆状的凝胶液连续倾入柱中，使其自然沉降，等凝胶沉降约2-3cm后，打开柱的出口，调节合适的流速，使凝胶继续沉集，待沉集的胶面上升到离柱的顶端约5cm处时停止装柱，关闭出水口。 （三）凝胶柱的平衡 通过2-3倍柱床容积的洗脱液使柱床稳定，然后在凝胶表面上放一片滤纸或尼龙滤布，以防将来在加样时凝胶被冲起，并始终保护凝胶上端有一段液体。 （四）加样 1.准备好部分收集器、核酸蛋白检测仪及记录仪 2.打开柱上端的螺丝帽塞子，吸出层析柱中多余液体直至与胶面相切。沿管壁将细胞色素C样品溶液1 mL小心加到凝胶床面上，应避免将床面凝胶冲起，打开下口夹子，使样品溶液流入柱内，同时收集流出液，当样品溶液流至与胶面相切时，夹紧下口夹子。按加样操作，用1 mL洗脱液冲洗管壁2次。最后加入3－4 mL洗脱液于凝胶上，旋紧上口螺丝帽，柱进水口连通恒压瓶，柱出水口与核酸蛋白质检测仪比色池进液口相连，比色池出液口再与自动部分收集器相连。 （五）洗脱 洗脱时，打开上、下进出口夹子，用0.025 mol/LTris-HCl，以每管3 mL/10 min流速洗脱，用自动部分收集器收集流出液。 六、注意事项 1）各接头不能漏气，连接用的小乳胶管不要有破损，否则造成漏气、漏液。 2）装柱要均匀，既不过松，也不过紧，最好在要求的操作压下装柱，流速不宜过快，避免因此压紧凝胶。 3）始终保持柱内液面高于凝胶表面，否则水分蒸发，凝胶变干。也要防止液体流干，使凝胶混入大量气泡，影响液体在柱内的流动。 薄层层析法（TLC） 引言 历史： 薄层层析法TLC：50 年代后在纸层析和柱层析的基础上发展起来 1951年J.G.kirchner首先对其进行了系统的研究 1958年E.Stahl对薄层层析用的吸附剂和涂层工具进行改进并使之标准化，克服了技术上的困难，使TLC获得迅速发展 定义： TLC是把固定相吸附剂铺在玻璃板上铺成均匀的薄层，把试液点在层析板（即薄层）的一端试样中各组分就被吸附剂所吸附，由于薄层的毛细管作用，展开剂沿着吸附薄层上升，试样溶解在展开剂中，在固定相和流动相之间不断的发生溶解、吸附、再溶解、再吸附的分配过程。 优点： 快速，做一次薄层层析只需10-60min； 分离效率高；灵敏度可达0.01μg； 层析后可用各种方法显色，甚至可喷强腐蚀性的浓硫酸，可高温灼热； 应用面广，可以进行定性及定量测定 对于各种试剂，可选用不同的吸附剂和展开剂 可做吸附层析、分配层析以及离子交换层析。 薄层层析法 原理 展开剂在薄层中的流速与展开剂的表面张力、粘度及吸附剂的种类、粒度、均匀度等等因素有关，即和层析系统（固定相和流动相）有关，也和展开距离有关。 塔板理论亦可应用于TLC中，将塔板高度和展开距离联系起来。 TLC中层析效率同样可用分离度表示。 Rs=2(x2-x1)/(w1+w2)。 当Rf=0.33时，Rs值最大，分离最好。 选择合适的吸附剂和展开剂是TLC分离能否获得成