第一节概述生化分析.pptVIP

二、影响泳动度的因素 1. 颗粒性质 颗粒的直径、形状及所带静电荷量对泳动速度有较大影响。一般来说颗粒带净电荷量越多，颗粒越小，或其形状越接近球形，在电场中的泳动速度就越快。反之则越慢。 3. 溶液的性质 主要是指电极溶液（缓冲溶液）和蛋白质样品溶液的pH 值、离子强度和粘度等。 （1）pH值：溶液pH值决定带电颗粒的解离程度，也决定了 其带净电荷的量。对蛋白质、氨基酸而言，当pH值等于其 pI时，净电荷为0，μ也为0。溶液的pH值离其等电点越 远，则其带净电荷量就越多，从而泳动速度就越快。反之， 则越慢。因此电泳时应选择适宜的pH值，并需采用缓冲溶 液，使溶液的pH值恒定。 （2）离子强度：溶液的离子强度一般在0.02－0.2之 间时，电泳较合适。若离子强度过高，则会降低颗 粒的泳动速度。其原因是，带电颗粒能把溶液中与 其电荷相反的离子吸引在自己周围形成离子扩散 层。若离子强度过低，则缓冲能力差，往往会因溶 液pH值变化而影响泳动的速率。在保持足够缓冲能 力前提下，离子强度要最小。 （3）溶液粘度：泳动度与溶液粘度是成反比关系。 因此，粘度过大或过小，必然影响泳动度。 4. 电渗 当支持物不是绝对惰性物质时，常常会有一些 离子基团如羧基、磺酸基、羟基等吸附溶液中的正 离子，使靠近支持物的溶液相对带电。在电场作用 下，此溶液层会向负极移动。反之，若支持物的离 子基团吸附溶液中的负离子，则溶液层会向正极移 动。这种溶液层的泳动现象称为电渗。 因此，当颗粒的泳动方向与电渗方向一致时，则 加快颗粒的泳动速度；当颗粒的泳动方向与电渗方 向相反时，则降低颗粒的泳动速度。 5. 焦耳热 在电泳过程中，电流强度与释放出热量（Q）之间 的关系可列成如下公式：? ?? ?? ?? ?? ?? ? Q＝I2Rt? ? 式中R为电阻；t为电泳时间；I为电流强度。公式表明，电泳过程中释放出的热量与电流强度的平方成正比。当电场强度或电极缓冲液中离子强度增高时，电流强度会随着增大。这不仅降低分辨率，而且在严重时会烧断滤纸或熔化琼脂糖凝胶支持物。 三、电泳的分类 1. 显微电泳 用显微镜直接观察细胞等大颗粒物质电泳行为 的过程。目前已用于研究膜结构及癌细胞和正常细 胞的差异性等方面。 2. 自由界面电泳 又称移动界面电泳，是指在没有支持介质的自 由溶液中进行的电泳。其装置复杂，价格昂贵，费 时费力，不能完全地分离混合物的各个组成等一些 不可克服的缺点，已逐渐为区带电泳所代替。 目前电泳的类型很多，最常见的是区带电泳，由于在支持物上电泳时各组分因迁移速度不同被分离成若干区带而得名。 3. 区带电泳 按支持物种类的不同，区带电泳可分为： 纸电泳：用滤纸作为支持介质，多用于核苷酸的定性定量分析。 醋酸纤维素薄膜电泳：医学上，常用于分析血清蛋白、胎盘球蛋白，其优点是简便迅速，便于保存照相，比纸电泳分辨率高。 以上两种类型的电泳，由于介质的孔径度大，没有分子筛效应，主要靠被分离物的电荷多少进行分离。 淀粉凝胶电泳：天然淀粉经加工处理即可使用，但孔径度可调性差，且批间质量相差很大，结果重现性差，电泳时间长，操作麻烦，分辨率低，很少使用。 琼脂糖凝胶电泳：一般用于核酸的分离分析。琼脂糖凝胶孔径度较大，对大部分蛋白质只有很小的分子筛效应。 聚丙烯酰胺凝胶电泳：可用于核酸和蛋白质的分离、纯化及检测。分辨率较高。 根据支持介质性状不同，区带电泳可分为：薄层电泳、板电泳、柱电泳。 根据用途不同，区带电泳可分为：分析电泳、制备电泳、定量免疫电泳。 一、缓冲液的选择 1. 首要条件：保证分离组分在此系统的溶解性能、 稳定性能及生物活性 2. 有较高的电泳速度 3. 有较高的分辨率 4. 对显色剂和紫外光吸收等观察电泳区带的方法没 有影响。 三、电泳操作要点 1．点样 对于未知样品，初次试验时应将样品点在纸 中央，以观察样品电泳时的移动方向； 对于已知样品，原点位置应根据经验进行选 择，但必须距离缓冲液液面5 cm以上，滤纸两端 应标明电极的极性“+”或“－”。原点形状一般呈 圆形或长条形，但长条形分离效果较好。但样品 量少时，则呈圆点，便于显色和定性。 点样方法 湿点法：将裁好的滤纸全部浸入缓冲液中，湿润后，取出，用滤纸吸干多余的缓冲液，置电泳槽架上，将滤纸两端浸入缓冲液中，然后用微量注射器精密点加供试品溶液。样品液要求较浓，不宜多次点样。 干点法：将供试品溶液点于滤纸上，吹干、再点，反复数次，直至点完规定量的供试品溶液，然后用喷雾器将滤纸喷湿，点样处最后喷湿，本法适用于稀的供试品溶液。 2. 电泳