UTMD增强载Cy3siRNA mPEGPLGAPLL纳米粒转染RPE细胞及其视网膜的实验的研究.pdfVIP

mPEG．PLGA．PLL纳米粒转染 UTMD增强载Cy3．siRNA RPE细胞及视网膜的实验研究 摘要 的新方法，但小干扰RNA(smallRNA，siRNA)转染效率低， interfering 半衰期短、体循环中极易被降解，长期稳定生效必须借助载体。阳离子 聚合物制成的纳米粒子做为新型的基因载体包裹DNA或RNA后，可有 效增加核苷酸进入细胞的量；保护核苷酸，使其免遭核酸酶的降解，增 强稳定性。本研究以生物可降解的三嵌段共聚物甲氧基聚乙二醇一聚乳 —CO—glycolicacid)。polyL-lysine， 建包裹荧光分子探针Cy3标记的siRNA载基因纳米粒子。探讨超声辐 色素上皮(retinal pigment microbubble 行性；探索超声靶向破坏微泡(ultrasound targeted 增强基因递送的新途径，并利用荧光分子探针精确定位纳米粒子在细胞 和活体内的分布，揭示UTMD基因递送系统增强载基因纳米粒子递送 的可能分子生物学机制。主要包括以下四方面内容： 第1部分载Cy3．siRNA 包裹荧光分子探针Cy3标记的siRNA载基因纳米粒子。并对其形态、 粒径大小及表面电荷分布进行表征，检测基因包封率和体外释放规律。 方法：采用复乳法制备载Cy3．siRNA 描电镜和电位／超细微粒粒度分析仪对所构建的载基因纳米粒进行表征， 高效液相色谱法测定纳米粒子内siRNA的包封率及体外释放规律，琼脂 糖凝胶电泳阻滞实验进一步考察纳米材料与siRNA的结合能力。 结果：扫描电镜证实载Cy3．siRNA 形，表面光滑，分布均匀；纳米粒子的平均直径是151±74nm：Zeta电 位为一O．13mV，高效液相色谱测得包封率为86．06％，在10天内，纳米 示纳米材料可以完全捆绑siRNA。 结论：采用复乳法本实验成功合成了包载Cy3．siRNA 达到治疗要求，为进一步的实验打下了基础。 第Ⅱ部分载Cy3．siRNA 效果和细胞毒性 Cy3．siRNA分子转染体外培养的细胞，沉默靶基因的表达，并考察其细 胞毒性。 fluorescent 方法：将稳定表达绿色荧光蛋白(green protein，GFP) siRNA转 mPEG．PLGA．PLL纳米粒介导荧光分子探针Cy3标记的GFP 染SPC．A1．GFP细胞(纳米粒子用量为0．6mg／孔，浓度为1．2 mg／mL， 0．8 包含siRNA siRNA的脂质体载体 Bg)，并以携带相同量Cy3．GFP 2000及单纯的siRNA为对照，加入转染试剂后，每孔 LipofectamineTM 加入一定量不含胎牛血清的培养基，确保液体总量为500山。转染后12 h，利用倒置荧光显微镜及激光共聚焦显微镜观察细胞内Cy3．GFP siRNA摄取效率及荧光强度。转染后48 h，使用倒置荧光显微镜观察 SPC—A1一GFP细胞绿色荧光蛋白的沉默效果，流式细胞仪检测基因表达 抑制效率。实时定量逆转录聚合酶链反应(real．time reverse quantitative chain transcript