游仆虫中GARP基因的克隆、表达及其光谱分析.pdfVIP

摘 要 中文摘要 含有三核苷酸重复序列的基因编码的蛋白在细胞生命活动中具有重要功能。 基因内三核苷酸重复序列拷贝数不稳定地异常扩展，可导致多种神经系统疾病。 从低等单细胞酵母到多细胞哺乳动物都广泛存在该类基因，表明这些基因在细胞 cerevisiae)全基因组 的生命活动中具有重要功能。在对酵母(Saccharomyces 序列分析发现，大部分三核苷酸重复序列存在于基因的开放读框中，这 些富含三核苷酸重复序列的基因多编码与基因转录和信号传导相关的 蛋白。也有的可能与核内蛋白有关。而这些序列在调控基因中的定位又 使其可能在生物进化过程中扮演重要的角色． 本研究以八肋游仆虫(Euplotes acid．rich 组中分离获得一种富含GAA编码谷氨酸的蛋白GAJt“glutamicprotein) 基因。该基因全长460bp，基因两端具有游仆虫大核特有的端粒序列(C4A4)4， 开放读框内含有一个TGA($8-901密码子，在游仆虫中编码为半胱氨酸。该基因编 码112个氨基酸，预测分子量为1296kDa，等电点3．82，含有四个a螺旋和一 首尾重复为删除信号。RT-PCR表明该基因具有转录活性。 利用定点突变技术，将G札RP基因中的TGA密码子突变为大肠杆菌中的通 BL21(DE3) 白硒SS．GARP与GARP均获得可溶性表达。E．coli 该蛋白以二聚体形式存在。 融合蛋白埘s6．GAI心及非融合蛋白GARP分别通过两次阴离子交换层析， 5％， 一次凝胶层析纯化达到电泳纯。融合蛋白Hiss．GAl冲的蛋白纯化得率为22 摘 要 制备了多克隆抗体，抗体效价l：100，000。用制备的多克隆抗体检测游仆虫总 蛋白，该蛋白在游仆虫细胞中主要以二聚体和四聚体形式存在。 GARP的紫外光谱的结果也证实了这一点。表明该蛋白与铜(1I)不能结合，His6 亲和臂干扰了该蛋白的荧光光谱分析。 关键词：八肋游仆虫；富含谷氨酸的蛋白：基因克隆：表达纯化：荧光与 紫外光谱 ABSll凇T CLENING，EXPItESSl0NANDANALYSISOFSPECTRITMOF 6爿R尸GENEF100ME卯E0飓譬DC八灭捌冗盯～■力四 JingXu andMolecular Biochemistry Biology DirectedAihua by Liang aminoacid arerelatedto Protei地containingsingle repeats and Iransduction．The wanscriptionsignal oftrinucleotide expansion in is to repeats relatedthe ofseveral genome phthogenesis deseases．A acid-r