单纯性马蹄内翻足和COL1A1基因的相关性的研究.pdf

·中文论著摘要· 单纯性马蹄内翻足与C,OLIA7基因的相关性研究 刖 置 talipes 单纯性马蹄内翻足(idiopathiccongenital 生时即可见的复杂的先天性足畸形。在不同的人群中，ICTEV的发病率有很大差 异，在我国约为O．6％o-1％o，男女之比约为2~2．5：1。近年来，国内外对于IcnⅣ 的发病机制争论较多，但均缺乏有力的证据。临床资料和流行病学研究表明，遗 传因素在ICTEV的发病过程中发挥重要的作用，但其遗传方式、外显率等均不清 楚。目前认为ICTEV主要是在肢芽发育的易损期，由于遗传因素和环境因素的共 同作用，某些与肢体发育有关的基因及其产物出现异常的结果。近年来，国内外 对ICTEV致病基因的分子水平上的研究很少，研究多集中于对一些合并有类似足 部畸形的综合征和多发畸形的研究。这些研究提供了ICTEV致病基因可能的侯选 号染色体中心粒周围区等，通过生物信息学可知这些区域内存在着一些与骨骼、 肌肉、肌腱、神经发育相关的基因，这为我们探寻ICTEV的易感基因提供了有利 的线索。 目前的研究表明，在ICTEV患侧组织中存在纤维组织明显增加，其中I型胶 原增加最显著。I型胶原是由两条a1链及一条以链组成的三股螺旋结构。I型胶 主要集中在外显子。COLlAl基因突变可导致多种疾病的发生，主要可引起先天 性成骨不全、Eiders a∞朋，基因与ICTEV相关性的进一步研究至今仍未见报道。本研究以COLlAl 基因为候选基因，将从分子水平上进一步探讨I型胶原基因与ICTEV发生的相关 性。 为了从RNA水平上进一步观察ICTEV中的COLIAl基因表达水平的变化， 本研究中我们首先构建了马蹄内翻足大鼠模型，并采用半定量RT-PCR的方 法，对后肢发育不同时期的模型胎鼠和正常胎鼠后肢组织中Collal基因的表 达水平进行了比较。接下来，我们又采用半定量RT-PCR方法，对20例ICTEV 患儿和4例正常儿童的肌肉和肌腱组织中COLlAl基因的表达水平进行了比 较。此外，为了探讨COLIAl基因表达水平变化的原因，我们选择了COLIAl 行了突变筛查。 材料与方法 一、研究对象： Wistar大鼠86只，包括雌鼠65只和雄鼠21只，均购自校动物部。 肌肉及肌腱标本来自于20例手术矫正的ICTEV患儿，取4例外伤及尸检 患儿相应组织作为正常对照，所有标本均经患者知情同意。 84例单纯性马蹄内翻足患者的静脉抗凝血，标本由中国医科大学第二临床 医院小儿外科提供。其中男性60例，女性24例(男女之比为2．5：1)；年龄最 大者28岁，最小者4个月；单侧马蹄内翻足者51例，双侧马蹄内翻足者33 例(双侧者占39．28％)；所有患者均具有典型的临床症状，经x线和手术确诊。 100例正常人DNA，研究对象均来自中国东北地区正常汉族人群。 。 二、实验方法 基因的表达 (1)构建大鼠模型通过在孕十天给孕鼠灌全反式维甲酸(135mg／kg体 重)和矿物油分别获得马蹄内翻足模型胎鼠及正常对照胎鼠。 (2)观察Collal基因在动物模型中的表达情况分别取孕15天，17天， 19天及21天的实验组和对照组胎鼠的后肢，常规提取总RNA并进行反转录 后肢发育不同阶段的表达情况。 2．半定量RT-PCR分析COLIAl基因在患儿及正常对照肌肉、 2 肌腱组织中的表达 (1)按常规方法提取患儿及正常对照肌肉、肌腱组织中的总RNA，并进行 反转录得到eDNA。 及正常对照肌肉、肌腱组织中的表达情况。 3．PCR．DGGE (1)PCR扩增明确COLIAl基因上游转录调控区和第1内含子的基因序 列，并应用Primer5软件设计引物(上海生工合成)，在上游引物的5’端加上40bp 的【Gc】夹。对84名单纯性马蹄内翻足患者DNA目的片段进行PCR扩增，并用 1．5％的琼脂糖凝胶电泳检测。 (2)DGGE检测以变性剂浓度范围为20％--80％的聚丙烯酰胺凝胶做水 平DGGE，并根据带形及其位置进一步调节变性剂浓度范围及电泳时间：电泳后， 下胶，溴化乙锭染