牛抵抗素基因的真核表达生物学活性鉴定.pdf

I Ill IIIIIIII lIIII ll III Y1 中文摘要 抵抗素是一种由白色脂肪组织的脂肪细胞分泌的新型小分子蛋白，是联系肥胖和 2型糖尿病的纽带，可减弱脂肪细胞、骨骼肌细胞、肝细胞胰岛素的敏感性。国内外， 抵抗素引起胰岛素抵抗的研究主要集中在小鼠和人，且机制研究尚无一致结论。而牛 抵抗素与胰岛素抵抗的关系研究少之又少，已有牛抵抗素基因的原核表达、酮病牛抵 抗素基因的真核表达的相关报道。但抵抗素基因真核表达产物有无活性，尚未见报道。 本研究分别进行了牛抵抗素基因克隆、真核表达及表达产物生物学活性研究，为 临床治疗动物糖代谢紊乱性疾病提供了科学依据。 试验从18月龄牛腹部脂肪组织中提取总RNA、反转录及PCR扩增，凝胶电泳 鉴定后连接T载体，再进行PCR和双酶切鉴定后送上海生工生物工程有限公司测序。 素基因克隆至pMDI8．T载体上，构建了pMD—Res重组克隆质粒；所获得的目的基因 为牛抵抗素编码基因。 设计真核表达引物，进行PCR扩增，连接T载体，进行双酶切鉴定后连接真核 表达载体pPICZaA，进行PCR和双酶切鉴定后测序。然后将成功构建的真核表达质 粒线性化，转到酵母中进行基因重组，经表型和PCR双重筛选后进行表达条件的优 缩纯化，得到纯化蛋白。试验结果表明成功构建出了牛抵抗素基因真核表达质粒 素真核表达体系的条件优化是甲醇浓度1．O％、表达时间72h，提高了蛋白表达量；经 过Dot．blot筛选，得到1株特别好的重组酵母表达菌株；成功表达出牛抵抗素蛋白， 分子量为14KD，并获得重组牛抵抗素蛋白。 每组5只。第1组(自由进食，注射不含重组牛抵抗素的PBS)、第1I组(自由进食， 第Ⅳ组(禁食2d，注射含l：1重组牛抵抗素的PBS)。四个组均在III、Ⅳ组小鼠开始 禁食时，均同时注射上述药物(每次1．5mg／只，每隔12h注射一次，连续注射4次)。 I ． 组牛抵抗素不论对自由进食或禁食2d大鼠的血糖浓度和胰岛素水平均具明显提高作 用，说明重组牛抵抗素具有明显的生物学活性。 取培养良好的肝细胞培养板(6孔板)，每孔分别接种重组牛抵抗素O、10、50、 后超声破碎，收集上清，采用考马斯亮蓝染色法测定上清液中牛抵抗素蛋白的含量。 酶(磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶)的比活性。结果表明PEPCK酶活性随重组牛抵抗素 浓度的升高而增强，10ng／L以上的重组牛抵抗素可明显提高PEPCK活性，再次证明 重组牛抵抗素具有明显的生物学活性。 综上所述，本研究成功地克隆了牛抵抗素基因，成功构建出了牛抵抗素基因的真 核表达质粒，表达产物(重组牛抵抗素蛋白)具有明显的生物学活性。 关键词：牛抵抗素：真核表达；磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶：血糖；胰岛素 II Abstract Resistiniskindofnovelsmall-moleculethatissecretedwhite cells． protein by adipose weakthe connects to 2 diabetes itcan Itisthelinkthat obesitytype mellitus，and offat cellstoinsulin．Thesearchthatresistininduced