慢病毒介导APP695基因RNAi对APP695转基因小鼠皮质神经元Aβ分泌凋亡影响.pdf

摘要 慢病毒介导APP695基因RNAi对APP695 转基因小鼠皮质神经元AB分泌及凋亡的影响 博士研究生 赵莘瑜 导 师 许予明 教授 郑州大学第一附属医院神经内科 河南郑州450052 摘要 阿尔茨海默病(Alzheimer’Sdisease，AD)患者的大脑皮层、海马等处大 量的老年斑(senileplaques，SP)形成，是其最主要的病理特征之一。B一淀 B)是SP的核心成份，AB是它的前体蛋白——B一 粉样蛋白(beta—amyloid，A 淀粉样蛋白前体(amyloid6-protein 而在脑组织中主要是APP695。一些证据表明，APP的过量表达可能是导致AB产 达2倍，并确认是由于APP695mRNA选择性升高所致。贾艳滨等发现AD患者血 浆中APPmRNA的水平显著高于正常人。 但是减少APP的生成是否可以减少AB的沉积，国内还未有报道。国外虽 有少数报道，但未使用皮质或海马神经元作为研究对象，而是使用高表达APP hamster 的CHO(Chinese ovary)细胞作为研究对象，更未使用APP转基因鼠 作体内外研究。AD转基因动物模型因为它具有明确的AD的病因，并且可以反应 AD主要的病理和功能上的变化，有希望成为研究老年性痴呆的理想的动物模型。 cDNA695V 我们选用C57BL／6J-APP转基因小鼠，它是将含有全长突变的人APP 717 摘要 13多肽，能够部分复制出AD的重要分子生化和病理改变，是目前研究AD基因 治疗的最佳动物模型之一。 因此我们应用RNA干扰(RNA 白有无抑制作用，并检测AB的生成，应用四甲基偶氮唑盐(MTT)检测神经元 经元的代谢及功能变化，从而试图为进一步探讨AD的病因以及可能的治疗途径 提供新的思路。 本研究分为以下三个部分： 第一部分APP695转基因阳性小鼠的鉴定及原代皮质神经元的培养 方法： 1．APP695转基因阳性小鼠的鉴定。 1．2鼠尾DNA提取。 1．3 PCR扩增。 1．4琼脂糖凝胶电泳。 2原代皮质神经元的培养 3神经元的鉴定 3．1 取培养7天的神经元用台盼蓝染色，计数神经细胞存活率达到95％以 上用于神经元鉴定。细胞存活率的计算：细胞存活率(％)=活细胞数“活细胞数+ 死细胞数)×100。 3．2 NSE鉴定神经元 结果： Ⅱ 摘要 1．采用PCR扩增技术，通过琼脂糖凝胶电泳分离，在284bp附近有一条明亮的 带，与目的基因APPDNA片段的预期位置相符，鉴定的阳性鼠占80％左右。 2．分离培养的神经细胞，24h后大部分细胞贴壁生长，伸出较长的突起，呈蝌蚪 样、不规则形，生长旺盛。2-一3d，从胞体伸出的突起增长增多，有的呈双极或 多极突起，能较明显地分辨神经元与残留的胶质细胞。6～7d，神经细胞的生长 更加活跃，胞体增大，突起交织成网状，形成神经细胞网络。 3．7d神经元台盼蓝染色法测定细胞存活率为(97．1±2．3)％。NSE鉴定：阳性 细胞胞浆呈棕黄或棕黑色，而阴性细胞胞浆不着色。培养7d神经元NSE阳性率 为(92．64-4．1)％。 转基因小鼠皮质神经元AB分泌的影响 方法： 1．实验分组 实验分为未经病毒感染(CON)组、阴性对照病毒感染(NC)组和慢病毒介导阳 性干扰(APP695一RNAi)组。 2．慢病毒感染原代皮质神经元 计一条阴性序列作对照，该阴性序列与小鼠、大鼠和人基因组缺乏序列同源性。 病毒液加