融合蛋白表达过程中N末端蛋白对下游蛋白正确折叠的影响.pdfVIP

Vol.35 高等 学校 化 学 学报 No.2 2014年2月 摇 摇 摇 摇 摇 摇 CHEMICALJOURNAL OF CHINESE UNIVERSITIES摇 摇 摇 摇 摇 摇 303~308 doi:10.7503/ cjc 摇 摇 融合蛋白表达过程中N末端蛋白 对下游蛋白正确折叠的影响 1 1 1 1 2 1 侯摇 玥 ,孙摇 非 ,金摇 倞 ,刘志屹 ,郑清川 ,梁重阳 (1. 吉林大学药学院,2. 理论化学计算国家重点实验室,长春 130021) 摘要摇 将灵芝免疫调节蛋白(LZ鄄8)与免疫球蛋白G的Fc片段(IgGFc)进行融合表达,通过ProteinA亲和层 析结合Superdex75分子筛层析获得了高纯度LZ8鄄Fc. 凝血活性实验结果表明,LZ鄄8与Fc融合表达在一定 程度上影响了其免疫活性;利用分子动力学和圆二色光谱等技术研究了LZ8鄄Fc 的蛋白折叠及组装方式,发 现LZ8鄄Fc 的组装方式与LZ鄄8相同,但是N末端的LZ鄄8可能影响下游IgG Fc片段的正确折叠,表明在融合 蛋白制备过程中,位于N末端的蛋白对下游蛋白的正确折叠起到重要作用,这为融合蛋白制备技术的优化 及应用过程中的稳定提供了重要的理论依据. 关键词摇 LZ8鄄Fc;分子动力学;二聚体 中图分类号摇 O629;O641摇 摇 摇 摇 文献标志码摇 A摇 摇 摇 摇 融合蛋白技术是将已有的2个或2个以上蛋白质或多肽的核酸序列以从 N末端到C末端的顺序 进行排列,使之重新表达成为一种新的蛋白质. 在自然界中,蛋白质因选择性压力而进化,从而能实 施诸多专一的功能,而其功能特性依赖于它们具有空间特征性的三维结构. 三维结构的产生是因为多 肽链中特定的氨基酸序列经折叠而由线性链构成有特异三维结构的紧密结构域. 融合蛋白技术将不同 功能的蛋白重新组合在一起,按照新的顺序进行折叠和修饰,这种组合方式对蛋白质结构形成和组装 的影响鲜见报道. 目前,融合蛋白技术是制备重组蛋白药物的最主要的方式之一[1~4] ,该技术领域普 遍存在的共性问题是2种蛋白融合后会产生不稳定性,且其原因至今尚未阐明. 当前的实验仪器很难 从原子尺度上观察到生物大分子在溶液中的行为,经过理论化学家和生物物理学家多年的努力,已可 以通过理论计算模拟的方法给出蛋白质内部运动随时间的变化情况,从而用于分析体系的诸多运动性 质;另一方面,动力学模拟计算中用到的各种势能参数来源于实验数据,它们对某一原子体系具有共 性,能够发现共有规律,进而推测出尽可能准确的分子结构信息[5~7]. 本文采用免疫球蛋白超家族中 的灵芝免疫调节蛋白(LZ鄄8)[8~17]与人免疫球蛋白IgG Fc段融合表达作为模型,二者的种属差异较大, 后者为融合蛋白表达技术领域中的常用蛋白质,通常位于融合表达的下游. 通过检测该模型蛋白的分 子量、等电点和活性,建立其分子动力学模型,并比较2 种蛋白融合表达后二级结构含量的变化,以 初步阐明上游蛋白在氨基酸折叠形成高级结构的过程中对下游蛋白的影响. 1摇 实验部分 1.1摇 试剂与仪器 X33菌种、pPICZ琢A质粒和博来霉素抗生素(Zeocin)购于美国Invitrogen公司;LZ8鄄Fc核酸序列及 相关引物由上海生工公司合成;DNA、蛋白质marker 和DNA聚合酶购于日本Takara公司;T4 连接酶 购于加拿大Fermentas公司;限制性内切酶BamHI,EcoRI和XhoI购于美国NEB公司;其它试剂胶回 收和纯化试剂盒购于美国Promega公司;LZ鄄8单克隆抗体由本实验室制备. Bio鄄flo510生物反应器(美国New Brunswick Scientific公司);AKTApurifier 100 制备液相色谱仪, 收稿日期:2013鄄11鄄04. 基金项目:国家自然科学基金(批准号和吉林省科技发展计划项目(批准号. 联系人简介:梁重阳