PCR产物的纯化.pptVIP

实验二 PCR产物的纯化 【实验目的】 通过本实验学习PCR产物纯化的原理与实验技术，为后续的连接反应和转化反应打下良好的基础。 【实验原理】 本实验采用了Takara公司的 Agarose Gel DNA Purification Kit试剂盒。该试剂盒采用了独特的凝胶融解系统，结合DNA制备膜技术，具有高效、快速、方便之特点，全套操作只需30分钟便可完成。回收纯化的DNA片段纯度高，完整性好，可直接用于连接反应、PCR扩增、DNA测序等各种分子生物学实验。 【仪器与试剂】 一、实验仪器 1、琼脂糖凝胶电泳系统 2、紫外观察分析仪（波长302 nm） 3、离心机（Eppendoff） 4、单面刀片 二、【试剂】 1、TaKaRa Agarose Gel DNA Purification Kit Ver.2.0 2、50×TAE 3、ddH2O 【实验步骤】 1、使用1×TAE缓冲液制作琼脂糖凝胶，然后对目的DNA进行琼脂糖凝胶电泳。 2、在紫外灯下切出含有目的DNA的琼脂糖凝胶，用纸巾吸尽凝胶表面的液体。 此时应注意尽量切除不含目的DNA部分的凝胶，尽量减少凝胶体积，提高DNA回收率。 注：切胶时请注意不要将DNA长时间暴露于紫外灯下，以防止DNA损伤。 3、 称量胶块重量，计算胶块体积。计算胶块体积时，以1mg＝1μL 进行计算。 4、向胶块中加入胶块融化液DR－I Buffer，DR－I Buffer的加量如下表： 5、均匀混和后，75℃加热融化胶块。间断振荡混和，使胶块充分融化（约6～10分钟）。 注：胶块一定要充分融化，否则将会严重影响DNA的回收率。 6、向上述胶块融化液中加入DR－II Buffer（体积为DR－I Buffer的1/2），均匀混和。 7、将试剂盒中的Spin Column按置于Collection Tube上。 8、将上述操作6.的溶液转移至Spin Column中，3600 rpm离心1分钟，弃滤液。 注：如将滤液再加入Spin Column中离心一次，可以提高DNA的回收率。 9、 将500 μL的RinseA加入Spin Column中，3600 rpm离心30秒，弃滤液。 10、 将700 μL的RinseB加入 Spin Column中，3600 rpm离心30秒，弃滤液 11、 重复操作步骤10.，然后12.000 rpm再离心1分钟。 12、将Spin Column按置于新的1.5ml的离心管上，在Spin Column膜的中央处 加入25 μL 的水，室温静置1分钟。 注：把水加热至60℃，使用时有利于提高洗脱液效率。 13、 12.000 rpm离心1分钟，洗脱DNA。 【思考题】 1、如何有效提高凝胶纯化PCR产物的效率？ * * 5个凝胶体积量 1.5％～2.0％ 4个凝胶体积量 1.0％～1.5％ 3个凝胶体积量 1.0％ DR－I Buffer使用量 凝胶浓度 实验操作流程图 切胶示意图 凝胶纯化结果示意图 *