RNA的制备及纯度的鉴定ppt.pptVIP

生物制药09303 第七组 指导老师：陈芬 （一） 操 作 方 法 6.思考问题 5.注意事项 4.工艺过程 3.仪器试剂 2.基本原理 1.背景知识 RNA的制备及 纯度的鉴定 背景知识 核糖核酸，简称RNA，主要以单链的形式存在于生物体内,其高级结构很复杂,它们既担负着储藏及转移遗传信息的功能,又能作为核酶在细胞内发挥代谢功能。生物体内共有三种RNA，即编码特定蛋白质序列的信使RNA；能特异性解读mRNA中的遗传信息、将其转化成相应氨基酸后加入多肽链中的转运RNA；直接参与核糖体中蛋白质合成的核糖体RNA。 mRNA的选择性拼接 合成类RNA RNA的生物合成 RNA/DNA诊断仪 实验目的 1 掌握从动物组织中提取RNA的基本原理和操作 2 掌握RNA纯度鉴定的原理和基本操作 3 进一步熟悉可见分光光度计的使用 实验原理 细胞内大部分RNA?均与蛋白质结合在一起，以核蛋白的形式存在。因此分离RNA时必须使RNA 与蛋白质解离，并除去蛋白质。 最常用含水的酚溶液除去蛋白质，去污剂和酚均能抑制RNA酶活力，有利于制备核酸大分子，以酚水两相系统分离RNA是将细胞或细胞器置于含有SDS的缓冲盐溶液中，加等体积水饱和的酚，通过剧烈振荡，然后离心形成上层水相和下层酚相。 实验所用的0.15mol/L缓冲盐溶液系统可使大部分核糖核蛋白解离，在用酚处理时脱氧核糖核蛋白变性；在低温条件下，从水相中除去，这样得到的RNA 制品中混杂的DNA量极低 ?　RNA制品继续用氯仿－异戊醇处理，可以进一步除去其中含有的少量蛋白质。最后用乙醇使RNA自水溶液中沉淀下来。 ? 实验所得制品的核酸含量可用地衣酚显色法测定RNA含量?。RNA与浓盐酸共热时，即发生降解，形成的核糖继而转变为糠醛，后者与3，5-二羟基甲苯（地衣酚）反应呈鲜绿色，该反应需用三氯化铁或氯化铜作催化剂，反应产物在670nm处有最大吸收。RNA在20～250 g范围内，光吸收与RNA的浓度成正比。 实验器材与试剂 器材：乳钵?、磨口 具塞锥形瓶 (500ml) 天平?、?离心 机（4000rpm）动物肝脏 、紫外可 见分光度计、恒温水浴锅 试剂： 1.SDS-缓冲盐溶液［0.3%SDS-0.1mol/L氯化钠 -0.05mol/L，pH5.0乙酸盐缓冲液］称取1.5gSDS，2.92g氯化钠，2.05g乙酸钠溶于水中，用乙酸调至pH5.0，最后定容至 500ml。2.含水酚液：使用前将苯酚重蒸(酚的沸点为181.8℃)并用SDS－缓冲盐溶液使其饱和。3.氯仿-异戊醇液：氯仿：异戊醇=24:1(V/V)。4.含2%乙酸钾的95%乙醇溶液。5.75%乙醇，95%乙醇、无水乙醇。6.乙醚7.RNA标准溶液（须经定磷确定其纯度）：取酵母RNA配成200 g/mL的溶液。8.地衣酚试剂：先配制0.1%三氯化铁的浓盐酸（分析纯）溶液，实验前用此溶液作为溶剂配成 0.1%地衣酚溶液。 实验步骤 一.实验前的准备 mRNA的分子结构容易受到RNA 酶的攻击反应而降解,加上RNA 酶极为稳定而且广泛存在,因此在提取过程中应严格防止RNA 酶的污染并设法抑制其活性。 所用的玻璃器皿需要置于干燥烘箱中 200.0°C烘烤两小时以上,凡是不能用高温烘烤的材料如塑料容器等可用0.1%的焦碳酸二乙酯（DEPC）水溶液处理，再用蒸馏水冲净。 RNA提取流程 2克动物肝脏组织 加20mlSDS缓冲盐溶液 倒入磨口具塞锥形瓶 室温剧烈震荡10分钟 研碎 加同体积含水酚溶液 水浴分层并离心 得上清液 加氯仿异戊醇震荡 离心取上清液 放置沉淀离心 洗涤沉淀离心干燥 将RNA溶于蒸馏水 离心得粗品 加2%乙酸钾乙醇溶液 二.实验过程 1.取2g动物肝脏组织，剪成小块，在乳钵种研碎，加20mLSDS-缓冲盐溶液（见试剂1.）使成均浆，倒入磨口具塞锥形瓶内，再加同样体积的含水酚溶液，室温下剧烈振荡10分钟。 2.置冰浴中分层，在0-4℃下，以4000rpmn离心15分钟。吸出上清液，加等体积氯仿－异戊醇，室温下剧烈振荡10分钟，以4000rpm离心5分钟，或在室温下放置10分钟使分层。吸出上清液（若有必要，该操作可反复多次），加2倍体积2% 乙酸钾的乙醇溶液，在冰浴中放置1小时使RNA沉淀，此沉淀液可在冰箱内较长期存放。 3.若要得到干燥制品，可将沉淀液以4000rpm离心10分钟，倾去上清液。沉淀用少许75%乙醇、95%乙醇、无水乙醇各洗1次，同上法离心，倾去乙醇后，空气干燥。 4.将RNA（准确称取30mg左右RNA干燥制品）溶于5～10mL蒸馏水中，离心除去不溶性杂质，得RNA粗品。 5.RNA纯度的鉴定