抗EHEC+O157：H7+Stx2a1的人鼠杂合Fab噬菌体抗体库的构建及其导向筛选.pdfVIP

0157：H7 抗EHEC Stx2a1的人鼠杂合 Fab噬菌体抗体库的构建及导向筛选 刘 璐 吴 剑 曾 浩 罗 萍 毛旭虎 邹全明 第三军医大学检验系临床微生物及免疫学教研室暨重庆市生物制药工程技术研究中心，重庆，400038 0157：H7 摘要 目的建立人一鼠杂合Fab噬菌体抗体库，筛选抗EHEC Stx2a。人源性抗 体轻链。方法：PCR扩增正常人外周血淋巴细胞人抗体全套轻链基因，克隆人含鼠源抗 EHEC0157：H7 库。通过稀释滴定、限制性酶切等分别对库容、基因重组率和多样性进行鉴定。以M13K07 辅助噬菌体超感染，利用纯化的Stx2al对杂合库进行筛选，对筛出的阳性克隆进行鉴定。结 果构建了库容量为3．2×106CFU、重组率为90％、多样性好的人一鼠杂合噬菌体抗体库。 ELISA检测出5个强阳性克隆，Westernblot确证其中4个为抗Stx2a。的人一鼠杂合Fab。 关键词 EHEC 0157：H7；Stx2al；人鼠杂合；噬菌体；Fab抗体库 E．co— 3．人抗体轻链九、K基因的PCR扩增 肠出血性大肠杆菌(entrerohemorrhagic zi，EHEC)0157：H7是一种新型的肠道致病菌，可取正常人的新鲜外周血约100ml，提取PMBC， 引起严重的食源性疾病。感染该菌可致腹泻、出血 Trizol裂解，提取总RNA，参照人源抗体库构建的 colitis，HC)，还可引发溶血 性结肠炎(hemorrhagic 引物设计IgG抗体引物(上海生工生物技术有限公 uremic 司合成)，应用RT—PCR一步法试剂盒进行逆转录 性尿毒综合征(hemolyticsyndrome，HUS) 及血栓性血小板减少紫癜(thrombotic PCR，扩增全套人抗体轻链基因。 thrombocy— 4．人鼠杂合噬菌体抗体库的构建 topenicpurpura，TTP)等严重并发症，严重者可导 致死亡[卜3|。目前，对EHEC0157：H7感染仍缺乏 有效的治疗方法。研究表明，直接针对EHEC因PCR产物，分别用XbaI、SacI双酶切后，回收 0157：H7最主要的致病活性分子Stx2A研制其中目的条带，连接，电转化大肠杆菌XLI—Blue，涂布于 和毒素抗体，将是研制0157：H7治疗性抗体药物 液转入一三角瓶，加入10ml 优选的设计策略。抗原表位定向选择法(EGS)是近 SB，含有20^tg／ml氨苄 年发展的快速人源化抗体的新方法。本研究拟采用 青霉素，37℃振荡培养1小时。加入100ml新鲜 抗原表位定向选择法，对已构建的鼠源抗EHECSB，含有100“g／ml氨苄青霉素，37℃振荡培养培养 0157：H7 Stx2a。噬菌体抗体进行人源化改造，从而1小时后，加入1．2ml辅助噬菌体进行超感染，先慢 为解决临床EHEC0157：H7感染者的治疗研究奠速震荡30rain，再用常规速度震荡培养1小时。加 定实验基础。 入卡那霉素(70“g／m1)，37℃震荡培养过夜。次日 将上述细菌培养液在4℃离心，将上清置另一无菌 材料与方法 PEG 三角瓶，加入49 8000