富血小板血浆凝胶复合脑源性神经生长因子修饰的骨髓干细胞在脊髓半横断损伤中的应用.pdfVIP

第四届中华骨科杂志论坛天津·2012 富血小板血浆凝胶复合脑源性神经生长因子修 的骨髓干细胞 在脊髓半横断损伤中的应用 浙江大学医学院附属第二医院骨科杭州310009 赵飞齐义营徐 陈其 陈维善 脊髓损伤导致神经功能严重障碍，哺乳动物脊髓神经再生一直是世界性的难题，神经不能重新生长并 与其下一级神经元形成有效的突触联系，往往归因于脊髓损伤后形成的空洞及其积的型胶质细胞阻碍 了神经的再生以及中枢神经本身再生能力较差等原因。基闪修 的干细胞移植治疗脊髓损伤在很多试验中 都表现出很大的潜能，其中以骨髓干细胞具备来源广、增殖快等特点而备受研究者们的青 。富血小板血 的作用。 们通过体外实验来证明PRP能否诱导BDNF修的骨髓干细胞向神经元方向分化，以及在大鼠半横断脊髓 损伤模型中联合BDNF修的骨髓干细胞和PRP移植治疗后的效果。 1材料与方法 1．1试剂、仪器与材料 Fluor488 Probes公司，GFAP、NF一200抗体 连宝生物公司，CM-Dil及Alexa 抗兔荧光二抗购自Molecular E1isa试剂盒购自 武 德， 凝血酶及Hoechst SP5，Leica)。 介导BDNF的腺病毒颗粒由上海基因公司构建，基冈序列参考Genebank中大鼠脑源性神经生长因子基因 1 ： 序列NM02513．3(上游：5 ， 下游 5一TCACcATGGTGGcGACCGGTCTTCCCCm从TGGTc一3 )。107只雌性SD大鼠，由浙江大学实验动物中心提供， 体重212—2809。 1．2细胞培养及目的基因转染 4周龄SD大鼠雌雄不限，将其拉颈处死，75％酒精浸泡10min，无菌条件下取出股骨，除去骨周围的 肌肉组织，剪开骨两端，显露骨髓腔，用lOmL注射器，以MEM培养液从一端冲洗骨髓腔，将骨髓冲到 平皿中， 用吸管反复 打液使其成为单细胞悬液。7天后开始传代，培养到第三代后同构建好的带目的基 体外实验，分三组：(1)MSC组：单纯3×105BMSC：(2)PRP／MSC组：3×105BMSC和lOglPRP混合培养： (3)PRP／BDNF—MSC组：3×i05BDNF-MSC和lOglPRP混合培养；2天更换一次PRP和培养基，共培养7 天和14天时检测各组GFAP、NF一200、MAP2、p70S6K的mRNA表达量。 1．3 PRP凝胶及复合干细胞支架的制备 ×105，PRP中具体生长因子的浓度未作检测。PRP复合细胞支架制备：5pl细胞悬液(3x105BMSC或 BDNF—MSC)、IOPlPRP和lOOIU凝血酶的充分混合后，置于细胞培养箱中备用。 1．4实验动物分组、大鼠半横断模型的建立及移植 u pl 87只雌性SD大鼠分为五组：1．PRP组(n=12)：植入15 l细胞 -476- 第四届中华骨科杂志论坛天津·2012 悬液(3×105BMSC)-q10lJl u 植入15 1 植入5u1细胞悬液(3×105BDNF—MSC)与lOuPRP支架，3只大鼠用来测BDNF在体内的表达。各