β1314葡聚糖酶基因双拷贝工程菌株的构建和发酵研究.pdfVIP

豢蕤耋纛蓑囊·蠡魏}辫a{So!e魏e垂曩冀≤Biotechoiogy 2013笨鬻4争卷蘩3期 卢一1，3-1，4葡聚糖酶基因双拷贝工程菌株 的构建与发酵研究 裴红蕾，陈轶群，吕俊楠，杨雯涵，李志民，曹云鹤+ (中国农业大学动物科技学院，动物营养学国家重点实验室，北京 100193) 摘 要：本试验旨在研究口一1，3—1，4葡聚糖酶双拷贝基因毕赤酵母工程菌株的构建及发酵。首先，通过对质粒 I和Not pGAP—glu—opt进行PCR3扩增获得密码子优化的口一1，3-1，4葡聚糖酶基因glu-opt，用EcoRI双酶切后与毕 Sac I线性化后转化毕赤酵@GSll5菌 赤酵母表达载体pPIC9K连接，获得重组质#ip9K—glu—opt。该重组质粒 次转化，在含有抗生素Zeocin 感受态细胞，再用线性化的重组质#ipPlC-glu-opt YPDS平板上筛选glu-opt基 L发酵罐中进行高密度发酵培养及甲醇诱导表达，口一 因双拷贝重组菌株GSll5／2xglu—opt。双拷贝重组菌在10 600 1，3-1，4葡聚糖酶最高酶活达到21 表达量达8．4 g／L，约为x33／pPIc—对u—opt的1．68倍。 关键词：／3-1，3-1，4葡聚糖酶；双拷贝；毕赤酵母；发酵 中图分类号：$816．7 文献标识码：A 文章编号：0258—7033(2013)03—0064—05 随着我国畜牧业的迅速发展，饲料资源不足，主要 达，且数量在不断增加，并非常适宜扩大规模生产【8】。 能量饲料玉米供应紧张，饲料用粮与工业用粮的矛盾 本实验室前期克隆了一株枯草芽孢杆菌的口一 再度凸显[1】。因此寻求其替代品已迫在眉睫。麦类是我 1，3—1，4葡聚糖酶基因，经过序列优化设计后，在毕 国的主要粮食作物，又是一种很好的玉米替代原料，可 赤酵母中进行了分泌表达，单拷贝工程菌发酵活力 000 以在很大程度上代替玉米应用于饲料生产。然而麦类 达到15 U／mL[9】。本试验旨在通过构建口一1，3一 饲料细胞壁中存在较高浓度的口一葡聚糖，极大地限制 1，4葡聚糖酶双拷贝工程菌株以提高其发酵活力， 了其在饲料工业中营养价值的发挥[21。口一葡聚糖酶可水 降低酶的生产成本。 篓生墓舅!篓望篓2：竺萎拿望篡卫骂墨_登竺孽皇童 一1材料与方法 “……一 物黏度、破坏细胞壁结构、改变消化部位、改变消化酶 活性和肠道形态结构及改善神经内分泌，因而在麦类 1．1 菌株和载体毕赤酵母表达载体pPIC9KI主t中国 饲料中添加口一葡聚糖酶可以提高畜禽的生长消化率、 科学院微生物研究所董志扬研究员惠赠。具有Zeocin 改善生长性能和促进机体免疫力嗍。 为降低生产成本、扩大规模效益，目前国内外主 要是用微生物法、基因工程手段制备口一葡聚糖酶[5]。 生物技术公司，毕赤酵母菌株GSll5由本实验室保存。 1．2主要培养基、试剂的配制LB培养基：胰蛋白 其中巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)相比于大肠杆 菌和酿酒酵母基因表达系统来说已基本成为较完善