紫杉醇在猪体外成熟卵母细胞玻璃化冷冻中作用探讨.pdfVIP

上海市畜牧兽医学会 2011 年学术年会论文集 紫杉醇在猪体外成熟卵母细胞 玻璃化冷冻中的作用探讨 1, 2, 3 1, 2, 3 1, 2 1, 2 王 磊 ，杨山亭 ，戴建军 ，吴彩凤 ， 张廷宇1, 2 ，张德福1, 2 （1.上海市农业科学院畜牧兽医研究所，上海 201106 ；2.上海市农业遗传育种重点实验室 动物遗传工程研究室，上海 201106 ；3.南京农业大学动物科技学院，南京 210095 ） 摘 要：使用 1.0 μmol/L 紫杉醇预处理卵母细胞，冷冻后其形态完整率(89.93%)和 FDA 染色存活率(83.33%) 都显著高于未处理组的 79.12%和 70.97% （P0.05 ）。在不同预处理时间上，预处理30 min 组冷冻后卵母细 胞形态完整率和 FDA 染色存活率最高，分别达到 90.21%和 84.13%。预处理浓度 1.0 μmol/L ，30 min 是比 较合适的处理方法；紫杉醇、细胞松弛素 B （Cytochalasin B ）前处理能显著提高猪成熟卵母细胞的玻璃化 冷冻的效果（P0.05 ），但两者之间没有显著差异（P0.05 ）。 关键词：猪；卵母细胞；玻璃化冷冻；紫杉醇 自 Whittingham[1]首次冷冻保存成熟的小鼠卵母细胞成功以来, 卵母细胞的冷冻保存已 在兔、山羊、牛、马等多种哺乳动物和人上获得成功。猪卵母细胞因含有较多脂质，冷冻保 存难度更大。近年来，多种冷冻方法应用于猪卵母细胞的冷冻，如以提高冷冻速率为代表的 OPS 和电镜铜网法等，以去除脂质颗粒为主的离心去脂法，以及以增加细胞骨架稳定性的 CB 添加法等等。这些方法的应用，使得猪卵母细胞的冷冻效率有了部分提高。 [2-4] 紫杉醇是一种微管稳定剂，已被证明可以降低冷冻对小鼠、牛和人卵母细胞的损害 。 目前，该物质在猪卵母细胞玻璃化保存中的应用较少，仍需进一步的研究。本试验以冷冻环 为冷冻载体，研究紫杉醇不同处理浓度和处理时间对猪 MII 期卵母细胞冷冻效果的影响， 以期为紫杉醇在猪卵母细胞冷冻中的应用提供参考。 1 材料与方法 1.1 猪 GV 期卵母细胞的采集及体外成熟 猪卵巢采自上海市闵行区复星屠宰场， 猪卵巢 采后置于 37 ℃生理盐水(含青霉素、链霉素各 500 IU/mL) 保温瓶内，在 1 h 内送达实验室。 将卵巢用杜氏磷酸盐缓冲液（PBS ，添加 1%新生牛血清）洗 3～4 次。用带有 12 号针头的 注射器分别抽吸卵巢表面直径为 2～6 mm 卵泡中的卵母细胞，抽吸的卵母细胞缓缓注入 10 mL 离心管中，37℃静置 10 min，弃去上清。在实体显微镜下捡取胞质均匀且包被 3 层及 3 层以上卵丘细胞的卵丘-卵母细胞复合体（COCs ），将采集的COCs 用 PBS 洗 2～3 次后再用 [5] TCM199 液洗 1～2 次，备用。成熟培养方法按本实验室常规方法进行 。 1.2 冷冻保护剂 所有试剂除特别说明外均来自SIGMA公司。冷冻保护剂基础液为TCM199 1 上海市畜牧兽医学会 2011 年学术年会论文集 （Gibco ）+20%胎牛血清(Hyclone) 。EDS1为基础液+ 7.5%EG+ 7.5%DMSO ，EDS2为基础液 + 18%EG+ 18%DMSO+ 0.4 mol/L蔗糖。解冻液1为基础液+ 0.13 M蔗糖，解冻液2为基础液+ 0.075 mol/L蔗糖。 紫杉醇taxol处理卵母细胞：在冷冻前将MII期卵母细胞置于含紫杉醇的TCM199 中，处 理温度为38.5℃，处理浓度和处理时间根据实验设计需要进行。 1