军曹鱼长激素（GH）基因cDNA的克隆和原核表达.doc

军曹鱼长激素(GH)基因cDNA的克隆和原核表达 作者简介：郝羽，女，24岁，硕士研究生，研究方向：水产经济动物发育生物学；Email：haoyu3016@126.com.通讯作者：刘楚吾，电话：0759-2382044 论文字数：4470 图数量：8军曹鱼长激素基因cDNA的克隆和原核表达 郝羽 邓思平 刘楚吾 （广东海洋大学水产学院，广东 湛江524025） 摘要: 提取军曹鱼脑垂体中总RNA,运用RT-PCR技术扩增并克隆得到军曹鱼生长激素(GH)基因cDNA全序列。分析其核苷酸序列和推测的氨基酸序列,结果显示:军曹鱼生长激素基因的开放阅读框(ORF)包括615个核苷酸;编码204个氨基酸;其中包括22个氨基酸的信号肽和182个氨基酸的成熟肽。将GH成熟肽的cDNA与表达载体pET-28a连接,构建重组质粒pET-CoGH,经IPTG诱导重组蛋白在大肠杆菌BL21(DE3)中表达, SDS和Western blot分析表明,表达的目的融合蛋白分子量为20.8 kDa。主要以非可溶性的包涵体形式存在于菌体沉淀中。 关键词:军曹鱼;生长激素基因;cDNA克隆；原核表达 Molecular Cloning of Growth Hormone-Encoding cDNA of Rachycentron canadus and Its Expression in Escherichia coli Hao Yu Deng Si-ping Liu Chu-wu (Fisheries College ,Guangdong Ocean University , Zhanjiang 　524025 , China)Abstract:GH cDNA was amplified and cloned from total RNA isolated from pituitary gland of Rachycentron canadum by RT-PCR. The sequence includes an ORF of 615bp which encodes a precursor of 204 aa comprising 22 aa signal peptide and an 182 aa mature protein. The cDNA fragment encoding the mature polypeptide of GH was PCR amplified and subcloned to expression vector pET-28a (Novagen), and expressed in E.coliBL21(DE3). SDSand Western blot analysis showed that the molecular weight of expressed fusion protein is 20.8 kDa. The expressed protein accumulated as inclusion bodies. Keywords: cobia; growth hormone gene; cDNA cloning; prokaryotic expression 鱼类生长激素(fish growth hormone ,fGH)是由鱼类脑垂体前叶合成和分泌的一种蛋白多肽，分子量为21~22 kD，对鱼类的生长起重要作用，除此之外，它还参与鱼类蛋白质的合成和多种代谢过程(Donaldson [1]),调节鱼类渗透压(Barrett [2]), 提高某些鱼类对盐水的适应力和提高鱼类对饵料的利用率,增强鱼类对环境的适应能力(Boeuf [3])。有研究证实，基因工程方法获得的生长激素具有代偿内源生长激素的功能，，Gill [4])；饵料中添加的生长激素可通过鱼体消化道后肠上皮细胞的胞饮作用吸收，，，Moriyama [5])。由于fGH在鱼体内含量极少，，，，，，[6])。军曹鱼为暖水性海洋鱼类，在我国主要分布于南海、东海，黄渤海也有出现。军曹鱼肉质细嫩、鲜美，为大型食用鱼，生长速度快，经济价值高，是市场上畅销的水产品，现已成为我国南方沿海一带的重要海网箱水养殖对象,国内外尚无文献报道。本研究运用RT-PCR方法对南海海域网箱养殖的军曹鱼生长激素（GH）基因进行克隆，并通过构建原核表达载体，生产外源生长激素。这可为生产大肠杆菌工程菌，实现外源蛋白在大肠杆菌中的高效表达提供前期基础。同时也可为实现转基因鱼育种以及生长激素制剂的开发奠定基础。 1材料与方法 1.1材料 1.1.1动物材料 军曹鱼购自湛江水产市场，体重3.7kg,体长60cm，健康活鱼。快速解剖，取其脑垂体。 1.1.2主