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常用细菌检测方法 一、[3H]脱氧胸苷摄入法测定细胞数： 1、用RPMI-1640培养液洗涤对数生长期（培养3天）的CTLL-2细胞两次，每次250×g离心 10分钟，洗去培养液中残存的IL-2。 2、用台盼蓝（1%Trypanblue）染色法计数细胞并决定细胞的活力，用10%小牛血清的RPMI-1640 培养液悬浮细胞至1×105/ml。 3、在96孔细胞培养板中每孔加0.1ml倍比稀释的标准IL-2或待测样品，每个稀释度三个复孔， 标准IL-2从40 IU/ml稀释到0.019 IU/ml（8～10个稀释度），阴性对照孔不加IL-2。 4、每孔加0.1ml细胞悬液，在37℃ 5% CO2的饱和水汽二氧化碳培养箱中培养18～24小时。 每孔加10μl（0.5μCi或1.85×104Bq）[3H]脱氧胸苷，继续培养4小时。 5、用多头细胞收集器将细胞收集到玻璃纤维滤纸上，用3%醋酸水溶液滤纸3次，洗去游离的 [3H]TdR。将滤纸置液体闪烁瓶中，加入5ml闪烁液。在液体闪烁仪上计数细胞摄入的同位素活 性（每分钟放射性计数，cpm），根据仪器效率换算成dpm（每分钟衰变数）。 6、用dpm值对样品稀释倍数作图。在图上，标准IL-2的曲线与待测样品的曲线应当呈平行的 S型，说明是同样的分子反应。比较同样dpm处的不同稀释倍数，决定待测样品的相应浓度。 二、MTT检测法： 1、取96孔细胞培养板，每孔中加0.1ml含2×104～10×104靶细胞的培养液（含10%小牛血 清的RPMI-1640培养液），在37℃ 5% CO2的饱和水汽二氧化碳培养箱中培养2～3小时让细胞 帖壁（如果是悬浮细胞可直接进行下一步） 2、用RPMI-1640培养液2～10倍递次稀释细胞因子标准品，根据情况2～5倍递次稀释待检样 品，每孔加0.1ml稀释的标准品和待检样品，每个稀释度3个重复孔。对照孔6个：3个阳性 对照孔，每孔加0.1ml含大剂量细胞因子的RPMI-1640培养液，3个阴性对照孔，每孔加0.1ml RPMI-1640培养液。在37℃ 5% CO2的饱和水汽二氧化碳培养箱中培养24～48小时或预定的时 间。 3、吸去培养液，用PBS洗涤一次（如为悬浮细胞，应在吸去上清液前离心培养板）。 中心以化工行业技术需求和科技进步为导向，以资源整合、技术共享为基础，分析测试、技术咨询为载 体，致力于搭建产研结合的桥梁。以“专心、专业、专注“为宗旨，致力于实现研究和应用的对接，从而推 动化工行业的发展。 科标化工分析检测中心致力于推动化工产业发展，欢迎各行同仁前来洽谈、合作。 4、每孔加0.1mlPBS和10μlMTT染液，在37℃ 5%CO2的饱和水汽二氧化碳培养箱中培养4～ 6小时。 5、每孔加0.1ml酸化异丙醇，也可用含10% SDS的10mmol/L HCl代替酸化异丙醇，在振荡器 上振荡混匀，让还原产物充分溶解。置酶联检测仪上测定光密度（OD）值，检测波长570nm， 参考波长630nm。以OD值对样品稀释度作图，比较标准曲线和待测样品曲线即可求得待测样品 中细胞因子的含量。 三、XTT检测法： 用XTT代替MTT可省去溶解还原产物结晶的步骤，XTT可以被活细胞中的代谢酶还原成黄色水 溶性的代谢产物（formazan）。代谢产物在OD450处有吸收峰。 四、MTS检测法： 1、培养IL-2依赖细胞株CTLL-2细胞或HT-2细胞（检测IL-2），或者IL-3依赖细胞株FDC-P1 细胞或FL5.12细胞（检测IL-3）到对数生长期。 2、取96孔细胞培养板，每孔加0.1ml含1×104～2×104上述细胞之一的DMEM培养液（加10% 小牛血清）。 3、每孔加0.1ml系列稀释的待测细胞因子（IL-2或IL-3）样品或细胞因子标准品，在37℃ 5% CO2的饱和水汽二氧化碳培养箱中培养24小时。 4、每孔加20μl MTS/PMS混合液，继续培养3～4小时显色。 5、检测前摇晃培养板10秒钟，混匀颜色。在酶联检测仪上，波长570nm（或490nm，或570nm 和690nm）处检测各孔的光吸收值（OD）。用样品稀释度对OD值（OD570、OD490或OD570/OD690） 绘制剂量-反应曲线，根据标准品曲线计算样品中细胞因子的量。 五、NAG检测法： 1、按MTT检测法培养细胞和用不同稀释度的细胞因子处理细胞。 2、吸去培养液，用PBS洗涤两次（如为悬浮细胞，应在吸去上清液前先离心）。 3、每孔加60μl NAG染液，在37℃ 5% CO2的饱和水汽二氧化碳培养箱中培养