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灵芝对皮肤纤维芽细胞DNA损伤的修复促进效果 村上祜子， 田中浩， 中田悟 日本美伊娜多化妆品株式会社综合研究所亍451-0071 日本国名古屋市西区鸟见盱J2-7 序言 皮肤位于生物体最外层，比其他部位更易受外来刺激、特别是紫外线的影响。紫外线会在两个DNA 嘧啶碱基(胞嘧啶或胸腺嘧啶)连续排列的部位，引起环丁烷嘧啶二聚体(cyclobutanepyrimidine 修复能力时，即引发皮肤老化和癌化。 excision 修复DNA损伤的原理有多种，核苷酸删除修复(nucleotide repair：NER)主要用于修复 修复类遗传性缺损会诱发色素性干皮症，NER作为针对紫外线诱发性皮肤癌的主要防御组织发生作用。 NER中，识别DNA损伤部位并将其切断的核酸内切酶、DNA单链断裂解旋酶、合成新的DNA 之聚合酶、DNA连接酶等，许多DNA损伤修复酶都参与其中。这些酶中，最近研究较多的是与色素 7种遗传基因产物与NER有关。 种原因遗传基因，其中XPA至XPG 最近研究表明，在人体表皮细胞中，原本用于修复因紫外线造成DNA损伤的DNA损伤修复酶， 也有可能因紫外线照射引起功能下降。DNA损伤修复酶功能下降是加速皮肤老化的原因之一，因此， 迅速恢复紫外线照射引起的DNA损伤修复酶的功能下降对于抗衰老是至关重要的。 灵芝(Ganoderma 国全国，生长在阔叶树的树段上，因含有灵芝酸而味苦，另含有B．葡聚糖等成分。研究报告指出其药 理作用包括抗肿瘤、增强免疫力、抑制血小板凝集等。中国最早的药学专著《神农本草经》上对灵芝 有“仙草“‘瑞草”之称，认为“久食，轻身不老，延年神仙”。我们通过考证灵芝长寿延年效果的记载，确 立了灵芝对皮肤的抗衰老作用这一课题。 本研究采用人体皮肤纤维芽细胞，就灵芝提取物对紫外线引起DNA损伤是否具有修复促进作用， 着眼于XP蛋白进行了研究。 实验 2．1．试料 灵芝(日本生药，富山)切小后，加入20倍的精制水，95C2小时加热提取，冷却后过滤得提取 液。提取液减压浓缩后，冻结干燥，获得灵芝提取物。另外，确认灵芝提取物在280nm波长处无特异 性吸收峰值。 2．2．细胞的培养 在理化学研究所细胞开发银行(茨城)，取自男性新生儿皮肤，调制、确定的正常人体皮肤纤维芽 细胞(NBlRGB)，用含10％胎牛血清(10％Fetal Modified -167· Medium)培养基在5％C02、37C条件下培养。实验采用继代数6．10的细胞。 Eagle 2．3．试料的添加 Il 将融汇状态的细胞用添加了1．0 2次清洗后，在含有PBS(：)状态下进行紫外线照射。然后，在添加了先前试料的培养基上继续培养， 用于实验。 2-4．紫外线照射 度计(ToPCON)测定紫外线强度，305nm波长下进行。 2．5．DNA损伤的免疫组织染色 细胞固定以及DNA损伤之——胸腺嘧啶二聚体的免疫组织染色按M耐团队的方法进行。即： lO分钟。为进行DNA单链处理，用70mM Chemical PBS(．)清洗10分钟。为进行RNase处理，用100 Co．， Goat 行Blocking，用含10％Normal 的PBS(．)进行3分钟、共计3次清洗。接着，用与胸腺嘧啶二聚体特异性结合的TDM．2单克隆抗体在 488 anti-mouse goat Dihy