细胞迁移侵袭试验技术(Transwell).docVIP

迁移实验（cell migration assay） 实验介绍细胞迁移与侵袭实验将Transwell小室放入培养板中，小室内称上室，培养板内称下室，上下层培养液以聚碳酸酯膜相隔，将研究的细胞种在上室内，由于聚碳酸酯膜有通透性，下层培养液中的成分可以影响到上室内的细胞，应用不同孔径和经过不同处理的聚碳酸酯膜，就可以进行共培养、细胞趋化、细胞迁移、细胞侵袭等多种方面的研究。实验步骤：1材料准备：可拍照显微镜，Transwell小室，孔径8μm，没包被胶的(Coster和Corning公司的也较常用)，Transwell迁移实验的细胞培养板24孔板。细胞培养板应当与购买的Transwell小室相配套，BD公司的Matrigel，无血清DMEM，(1%胎牛血清)DMEM和1640培养基，DMEM完全培养基，1640完全培养基（也可加到20%血清），无菌PBS，棉签，胰酶，4%多聚甲醛固定液或者甲醇，结晶紫染液（0.1%（g/ml）PBS结晶紫）2步骤和流程2.1基质胶铺板：用BD公司的Matrigel 1：8（根据细胞产生mmp的量来决定）稀释，包被Transwell小室底部膜的上室面，置3730min使Matrigel聚合成凝胶。使用前进行基底膜水化。2.2制备细胞悬液制备细胞悬液前可先让细胞撤血清饥饿12－24h，进一步去除血清的影响。但这一步并不是必须的。消化细胞，终止消化后离心弃去培养液，（用PBS洗1－2遍），用含BSA的无血清培养基重悬。调整细胞密度至5×105/ml。2.3接种细胞取细胞悬液100μl加入Transwell小室。24孔板下室一般加入600μl含20%FBS的培养基，特别注意的是，下层培养液和小室间常会有气泡产生，一旦产生气泡，下层培养液的趋化作用就减弱甚至消失了，在种板的时候要特别留心，一旦出现气泡，要将小室提起，去除气泡，再将小室放进培养板。培养细胞：常规培养12－48h（主要依癌细胞侵袭能力而定）。24h较常见，时间点的选择除了要考虑到细胞细胞侵袭力外，处理因素对细胞数目的影响也不可忽视。2.4结果统计直接计数法，“贴壁”细胞计数，这里所谓的“贴壁”是指细胞穿过膜后，可以附着在膜的下室侧而不会掉到下室里面去，通过给细胞染色，可在镜下计数细胞。取出Transwell小室，弃去孔中培养液，用无钙的PBS洗2遍，甲醇固定30分钟，将小室适当风干。0.1%结晶紫染色20 min，用棉签轻轻擦掉上层未迁移细胞，用PBS洗3遍。400倍显微镜下随即五个视野观察细胞，记数。 实验材料 Transwell chamber: 24-well, 8.0-μm pore membranes (Corning) （2）细胞培养相关试剂：无血清培养基，10％血清培养基，PBS，0.02％EDTA 固定液：甲醇 染色液：Giemsa染液 封片剂：中性树胶 其他：小镊子，棉棒，载玻片，盖玻片 操作步骤 所有细胞培养试剂和Transwell chamber 放在37℃温育 （2）待测细胞培养至对数生长期，消化细胞，用PBS和无血清培养基先后洗涤一次，用无血清培养基悬浮细胞，计数，调整浓度为2×105 /ml （3）在下室（即24孔板底部）加入600－800μl 含10％血清的培养基，上室加入100－150μl细胞悬液，继续在孵箱培养24小时 （4）用镊子小心取出chamber，吸干上室液体，移到预先加入约800μl甲醇的孔中，室温固定30分钟 （5）取出chamber，吸干上室固定液，移到预先加入约800μl Giemsa染液的孔中，室温染色15－30分钟 （6）轻轻用清水冲洗浸泡数次，取出chamber，吸去上室液体，用湿棉棒小心擦去上室底部膜表面上的细胞 （7）用小镊子小心揭下膜，底面朝上晾干，移至载玻片上用中性树胶封片 （8）显微镜下取9个随机视野计数，统计结果 注意事项 根据待测细胞体积大小选择合适孔径的chamber。常用的为8.0-μm孔径（如AGS细胞），如果细胞体积较大可以考虑用10-μm孔径； 根据待测细胞的迁移能力强弱调整细胞数和迁移时间。常规24-well chamber接种细胞数约为25×104/well，迁移时间1236小时； 由于Corning公司的24-Transwell内含12个独立的chamber，为了避免操作污染，每次实验可预先另准备一块24孔普通培养板（Corning）； 如果细胞迁移能力较弱，下室液体可用3T3细胞无血清培养24小时获得的上清加50μg/ml FN（Fibronectin），具体可查阅相关文献； 细胞悬液加入膜中央，尽量保证液面水平； 固定染色擦洗时动作小心，避免擦去膜底面的细胞。但一定要充分擦净膜表面上未迁移的细胞，以免影响读数。尤其是