人血清中吴茱萸碱与吴茱萸次碱的HPLC-MS检测.pdfVIP

人血清中吴茱萸碱和吴茱萸次碱的HPLC．MS检测 文大为 廖一平刘虎威木 北京大学化学与分子工程学院100871北京 Fructus) 中的吲哚生物碱类天然生理活性物质。这两种生物碱均有镇痛、升高体温和轻度影响呼吸与 血压的特性，一般被用作利尿与发汗剂。近年以来，吴茱萸碱在癌症研究上成为了新的热点， 这种化合物被证实对于多种恶性肿瘤可以起到诱使癌细胞凋亡，以及阻止肿瘤细胞扩散等作 用11，2】。对于这一类生物碱分离和测定的HPLC方法[3】和基于HPLC方法的药代动力学研 究【4】已有文献报导，但是截止到目前尚无对此类生物碱质谱方面的研究。本文建立了对生 化样品中吴茱萸碱和吴茱萸次碱的固相萃取流程以及HPLC．ESI．MS检测方法。利用MS的 高灵敏度，良好的抗干扰能力，实现了血清样品中痕量吴茱萸碱和吴茱萸次碱的分离和检测。 本工作为医药研究，尤其是癌症研究中这类生物碱在细胞甚至细胞器水平上的药理效应和作 用机理研究提供了有效的分析方法。 1．实验试剂、仪器与方法 吴茱萸碱和吴茱萸次碱标准品由中国协和医科大学药用植物研究所提供，用80％甲醇 分别配制成0．5 mg／ml和0．52mg／“的储备溶液，用同样溶剂稀释以配制后续实验中的标准 析纯，北京化工厂)。实验用水全部使用娃哈哈纯净水。 1100高效液相色谱系统，配备DAD检测器及相应色谱工作站， HPLC分析使用Aglient MS 质谱分析使用Agilenttrap XCT离子阱质谱仪，配备电喷雾(ESI)离子源及相应质谱工作 X4．6 站。色谱条件为：色谱柱，WinchromGPCI8，150 mm，5pan(由北京蕴泉公司提供)；流 测波长280am。DAD检测器出口与质谱仪连接，使用ESI电离源，正离子模式检测。干燥 气压力50Psi：干燥气流量10L／min；干燥气温度350。C，毛细管电压3000V；碎裂电压80．O v；扫描范围100—350m／z，选择性离子检测目标离子304m／z(吴茱萸碱)和288m／z(吴茱萸 次碱)。 对人血清样品采取加样回收的方式测定回收率，每份样品用血清lml，加入相当于吴 茱萸碱和吴茱萸次碱各50 C18键合固定相填料 ng的标准品储备液。样品处理采用含有0．39 的固相萃取柱(由北京蕴泉公司提供)。萃取血清后的固相萃取柱用高纯氮气吹干后，以0．5 ml50／50甲醇．乙酸乙酯淋洗，再以0．15“甲醇淋洗固相萃取柱三次，合并每一次的洗脱液， 约0．9ml，加纯水定容至1．0lIll，以调整溶剂强度。处理后的样品与标准溶液在同样条件下 进行分析。 216 2．实验结果与讨论 吴茱萸碱和吴茱萸次碱的定量采用各自的准分子离子峰M+H+的峰面积。因此，在实 验中选择了非常低的质谱碎裂电压，以保证绝大多数准分子离子的完整，从而获得较好的线 性关系与较佳的检测限。本方法没有采用质谱定量中常用的内标法，但依然获得了对于质谱 定量来说非常良好的线性关系与精密度。 对于实际样品(色谱图见图1)，本方法的检测限可达到1．0 nedma(吴茱萸碱)，和2．6 ng／wa(吴茱萸次碱)，较之现行的HPLC．DAD检测方法将检测限降低了两个数量级；线性范 围分别为10—500 ng／rIll，线性相关系数均为0．9998，方法的RSD％可控制 ng／mi和5．2—520 在4％以下(吴茱萸碱2．99％，吴茱萸次碱3．82％，n_5)，对血清中50ng／ma浓度的目标物质