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第五章 分子生物学研究方法（上） 分子生物学研究之所以从20世纪中叶开始得到高速发展，其中最主要的原因就是现代分子生物学研究方法、特别是基因操作和基因工程技术的进步。 基因工程是指在体外将核酸分子插入病毒、质粒或其它载体分子，构成遗传物质的新组合，使之进入原先没有这类分子的寄主细胞内并进行持续稳定的繁殖和表达。 外源核酸分子在另一种不同的寄主细胞中的繁衍与性状表达的过程. 基因工程技术区别于其它技术的根本特征：具有跨越天然物种屏障、把来自任何生物的基因置于毫无亲缘关系的新的寄主生物细胞之中的能力。 在生理条件下，核酸分子之糖-磷酸骨架中的磷酸基团，是呈离子化状态的，所以，DNA和RNA多核苷酸链又被称为多聚阴离子（polyanions），把这些核酸分子放置在电场当中，它们就会向正电极的方向迁移。由于糖-磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双链DNA几乎具有等量的净电荷，因此它们能以同样的速度向正电极方向迁移。在一定的电场强度下，DNA分子的这种迁移速度，亦即电泳的迁移率，取决于核酸分子本身的大小和构型。 5.2.3 聚合酶链反应技术 聚合酶链式反应，即PCR技术，是指通过模拟体内DNA复制方式在体外选择性地将DNA某个特定区域扩增出来的技术。 PCR Cycle - Step 1 - Denaturation Template DNA by Heat (95oC) PCR Cycle - Step 2 – Temperature is lowered (Tm ) and primers anneal to target sequences PCR Cycle - Step 3 - At 72 o C Taq DNA polymerase catalyses primer extension as complementary nucleotides are incorporated End of the 1st PCR Cycle – Results in two copies of target sequence Target Amplification 实时定量PCR(real time quantitative PCR)技术：利用带荧光检测的PCR仪对整个PCR过程中扩增的DNA累积速率绘制动态变化图，通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法，消除了在测定终端产物丰度时较大变异系数的问题。 5.2.5 基因组DNA文库构建 基因组DNA文库（genomic DNA library）：是某一生物体全部或部分基因的集合。将某个生物的基因组DNA片段与适当载体在体外重组后，转化宿主细胞，所得的菌落或噬菌体的集合即为该生物的基因组DNA文库。 2 构建基因文库的基本程序 1)提取研究对象基因组DNA，制备合适大小的DNA片段； 2) DNA片段与经特殊处理的载体连接形成重组DNA； 3)重组DNA转化宿主细胞或体外包装后侵染受体菌； 4)阳性重组菌落或噬菌斑的选择。 为保证能从基因组文库中筛选到某个特定基因，基因组文库必须具有一定的代表性和随机性。 提高文库代表性的策略： 用机械切割法或限制性内切核酸酶切割法随机 断裂DNA，以保证克隆的随机性。 增加文库重组克隆的数目，以提高覆盖基因组、 的倍数。 确定未知样品的 Ct值 通过标准曲线由未知样品的Ct值推算出其初始量 Sample 实时荧光定量PCR原理 绝对定量 25 非特异性荧光标记： 1、 SYBR Green I 特异性荧光标记： 2、TaqMan DNA 产物的荧光标记 非特异性荧光标记——SYBR Green I法 SYBR Green I 激发光波长520nm，可掺入DNA双链，荧光信号增强800－1000倍。 SYBR Green I 法 工作机理 SYBR Green I 能结合到双链DNA的小沟部位 SYBR Green I 只有和双链DNA结合后才发荧光 变性时，DNA双链分开，无荧光 退火和延伸时，形成双链DNA， SYBR Green I发荧光，在此阶段采集荧光信号。 SYBR Green I SYBR Green I 工作原理 5’ 3’ 5’ 3’ SG No Emission SG SG SG Excitation SG SG SG SG SG SG SG 5’ 3’ 5’ 3’ Emission Exci