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第二届中国资源生物技术与糖工程学术研讨会论文集 2007．07．15．18威海 白蚁纤维素酶的研究 倪金凤 山东大学微生物技术国家重点实验室，济南250100；0531 能源、环境问题是21世纪整个人类生存发展所面临的主要挑战，是制约我国社会 经济发展的主要因素。能源危机、环境恶化等严峻问题促使人们寻找可再生能源与资源。 以纤维素为主要组分的生物质是地球上含量最大的可再生资源，每年通过光合作用而产 源。利用生物技术高效转化纤维素类可再生资源，发酵生产乙醇等替代能源及各种化工 产品，具有重要的现实意义和广阔的发展前景。纤维素酶是实现生物技术高效转化纤维 素的主要瓶颈，围绕纤维素酶在真菌、细菌等领域已开展了广泛而深入的研究。白蚁纤 维素酶的研究起步晚，研究较少，随着世界能源问题的日趋严重，近年研究速度加快。 一、动物纤维素酶的研究 在传统的认识中，动物自身不含纤维素酶，昆虫白蚁等动物能够消化纤维素，是 通过它体内共生菌、原生动物分泌的纤维酶发挥作用。这种认识直到1998年在自然及 PNAS杂志上报道从白蚁和线虫自身克隆出纤维素酶基因而发生根本转变。到目前为止大 爪小龙虾、福寿螺、贝和海胆等[4—8]草食性软体动物中分离与克隆。这些动物纤维素 酶主要是内切一13-1，4葡聚糖酶和13一葡萄糖苷酶，但是从福寿螺的胃液中纯化的纤维素 种活性，是一种多功能纤维素酶(EGX)。动物纤维素酶一般不含纤维素结合域(线虫例 外)，分子量较小，小于66kDa。根据其氨基酸序列，它们分别属于糖苷水解酶家族5、 9和45。。 二、白蚁纤维素酶分离与纯化 中分离纯化得到两种纤维素酶，YEGl和YEG2，分子量分别为42和41kDa[9]。这两种 对 羧甲基纤维素钠有最高活性，分别是73．6U／mgprotein(YEGl)和83．4U／mgprotein 葡萄糖。这两种酶都能水解五糖，但不能降解二糖。有意思的是YEGl和YEG2还能水解 结晶纤维素生成纤维二糖和少量葡萄糖。 蛋白质印迹和免疫组织化学法证明纤维素酶 无鞭毛虫)Nasutitermes B一葡萄糖苷酶活性，并证明B一葡萄糖苷酶活性主要存在于唾液腺(66．7％)，而内切一 子量为47 kDa，具有很高的比活性，达1200U／mg，最适pH和最适温度分别是5．8，65 oC。2002年，Nakashima等研究发现家白蚁Coptotermes 的纤维素降解系统，一套是Coptotermes特有的纤维素酶，分布在唾液腺、前肠和中肠， reesei 学特性虽有不同(酶比活性不同，降解结晶纤维素能力不同)，但都仅由一个催化结 构域组成，分子量较小，成分简单，在较宽pH范围内保持高酶活。 三、白蚁纤维素酶基因的克隆与表达 第二届中国资源生物技术与糖工程学术研讨会论文集 2007．07．15．18威海 自1998年第一个纤维素酶基因从白蚁自身克隆出来。到现在约有4科6属9种白 蚁及其体内共生物的纤维素酶基因被克隆测序。最近美国佛罗里达大学研究人员又报道 从低等白蚁克隆了四个纤维素酶相关基因，其中只有1个是白蚁自身的，其它3个基因 来源于白蚁消化道内的共生微生物。序列分析表明这几个基因序列同葡聚糖内切酶、葡 聚糖外切酶及木聚糖酶的序列类似[12]。已知几种白蚁内源性葡聚糖内切酶基因(EG) 为1299bp，编码448aa，其中N末端含有20aa组成的信号肽。EG基因在￡coli中 难于表达，这阻碍了白蚁纤维素酶的应用。利用不同种白蚁EG基因的高度同源性，通过 coli的异源 酶分子家族定向进化(familyshuffling)可以实现白蚁葡聚糖内切酶在E 表达[13]。筛选获得的重组突变体酶的比活性比原始酶提高16倍，耐热性增加10度 [143，在实验室50m1小规模培养体系，酶的生产量可达20 m