宁波地区阴沟肠杆菌质粒型AmpC酶基因研究与一种新型ACT-1基因的初步发现.pdfVIP

诊断此病瘀斑穿刺渗出液涂片往往不容易找到细菌，由于穿刺渗出液量少，不会考虑培养，一 般都进行血及脑脊液培养。脑脊液外观浑浊，白血球明显增高，分类以中性粒细胞为主，潘氏试验 阳性。而该病人的脑脊液检查无变化，脑脊液及血培养为蜡样芽孢杆菌，无脑膜炎奈瑟菌生长。瘀 斑穿刺渗出液涂片在细胞内找到大量的革兰阴性双球菌，并经培养证实，极为罕见，相关机理有待 进一步探讨。 从这一患者说明，要采集不同标本进行培养提高阳性率，尤其不能忽视瘀斑穿刺渗出液的涂片 及培养，否则会使疾病漏检，造成误诊。 宁波地区阴沟肠杆菌质粒型AmpC 酶基因研究及 一种新型ACT-1 基因的初步发现 1 1 2 3 4 5 1 1 王卫华 陈 洁 毛雄英 许小敏 黄志刚 孙 　 汪 丽 吕婉飞 1 2 宁波大学医学院附属医院； 宁波市医学科学研究所分子诊断中心； 3 4 5 宁波市第二医院； 宁波市第一医院，； 宁波市李惠利医院 阴沟肠杆菌是肠道正常菌丛的成员，在环境中广泛存在，近年来逐步成为医院获得性感染的重 要菌种；另据报道，越来越多的阴沟肠杆菌临床分离株携带有质粒AmpC 酶耐药基因，且可在细菌间 快速水平传播，对控制细菌感染构成极大挑战，而目前检测质粒AmpC 酶的方法尚不能在临床常规开 展，故不能及时掌握其动流行动态；为此，我们对宁波市几家综合性医院近年分离的阴沟肠杆菌进 行了质粒AmpC 酶检测，结果如下。 1．材料和方法 1.1 材料 1.1.1菌株来源：85株阴沟肠杆菌分离自2005年3月至2006年4月宁波市几家综合性医院痰液、尿液、 伤口分泌物等标本，细菌鉴定用法国VITEK-32自动细菌鉴定系统，药物敏感试验采用GNS143卡；质 粒AmpC酶阳性菌株029M由陈民钧教授惠赠。 1.1.2 主要仪器及试剂：VITEK-32型细菌鉴定仪；德国Biometra T-Gradient PCR扩增仪；DNA分子 量标准购自上海生工。测序仪器为ABI PRISM 3730，测序试剂为BigDye terminator。DHA、ACT-1 基因引物参照文献设计，序列见表1，PCR试剂盒及DHA、ACT-1阳性对照由无锡市克隆遗传技术研究 所提供。 表1 AmpC 酶PCR 扩增引物 基因 引物序列（5′-3′） 扩增 DHA P1: AAC TTT CAC AGG TGT GCT GGG T 405 P2: CCG TAC GCA TAC TGG CTT TGC 片段长度（bp） ACT-1 P1: TCG GTA AAG CCG ATG TTG CGG 302 P2: CTT CCA CTG CGG CTG CCA GTT ～623～ 1.2 方法 1.2.1 DNA模板提取:挑取菌落少许置入50µl裂解液（0.5%的NP40，400µg/ml蛋白酶K）中，混匀后放 55℃消化60min，再95℃放5min，10000rpm离心30s，取上清作为模板。 1.2.2 AmpC酶基因检测：将上述模板加入含耐热酶的反应液中，反应体系为：P1、P2引物各0.5µM， KCl 10mM，（NH ）SO 8mM，MgCl 2 mM，Tris-HCl（pH9.0）10mM，NP 0.5%，BSA 0.02%（W/V）， 4 2 4 2 40 Taq DNA酶1U，总反应体积20µl（其中模板5µl）；上PCR仪，热循环参数为: 9