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实验四 细胞器的分离 实验目的 实验原理 实验步骤 作业 返回大纲 实验目的 了解用差速离心的方法分级分离细胞 组分的原理和过程。 熟悉离心机、匀浆器的使用方法。 返回 实验原理 为了研究某种细胞器的结构、功能或制备某种生物大分子，常需要大量采集细胞的某些亚组分，因此，有必要分离细胞器。 细胞内各种结构的密度、形状、大小各不相同，因此它们在同一离心场内的沉降速率就不相同。而且在进行沉降时各自要求的离心力也不相同。差速离心的方法就是根据这一原理，利用不同的离心速度所产生的离心力，将各种亚细胞组分和颗粒分别分离开。当离心力低，离心时间短时，细胞核即可沉到管底；加大离心力后，又可分离出线粒体：离心力再加大，又能分离出微体和核糖体。 实验原理 除了差速离心法，还可也使用在差速离心法基础上改进产生的密度梯度离心法来进行细胞亚组分的分离。这一方法是使离心溶液含有密度逐步增加的（密度梯度）极易溶解的惰性物质，例如蔗糖，利用这一密度梯度来维持重力的稳定性和抑制对流。操作时，将细胞匀浆液置于离心管的最上层，随后离心，这样，不同大小、形状、密度的细胞结构，由于它们的沉降系数不同，就会以不同的速率向下移动，分别集中到相应的密度区带而得以分离。 需要注意的是，在离心分级分离前，必须先进行细胞匀浆，使细胞破碎，释放出各种亚细胞组分。 返回 实验步骤: 蛙肝 ↓冷生理盐水10ml洗，吸干水分,放在小烧杯中, ↓加入预冷蔗糖液(少于9ml),剪碎 匀浆 ↓纱布过滤 滤液→做涂片① ↓2000 rpm离心10 min 沉淀 上清液 →作涂片② ↓加预冷蔗糖液至8ml，吹打均匀 ↓11000 rpm离心20 min，弃上清液 混合液 沉淀 ↓2000 rpm离心10 min，弃上清液 ↓加预冷蔗糖液，吹打均匀 沉淀 混合液 ↓加0.3—0.5ml蔗糖液，混匀 ↓11000 rpm离心20 min 作涂片③ 沉淀 上清液 ↓ ↓ 作涂片④ 作涂片⑤ 返回 实验步骤 ①、②、③片，自然干燥后，滴加1—2滴Giemsa染液染色15—20min，用蒸馏水洗，镜检。 ④片先滴1—2滴健那绿—B于玻片上，挑少许沉淀在染液中混匀，染5min，加盖片镜检。 ⑤片先滴1—2滴健那绿—B于玻片上，滴一滴上清液在染液中混匀，染5min，加盖片镜检。 返回 作业： 描述鉴定观察的各张片子的结果。根据你的实验结果，你认为所分离的细胞核和线粒体的纯度如何？ 返回