血红蛋白的提取与分离1.pptVIP

① SDS-聚丙烯酰胺分离胶制备：用去离子水4.6 mL，30%的丙烯酰胺2.7 mL，1.5mol、pH 8.8的Tris缓冲液2.5 mL，10%的SDS 0.1 mL，10%的过硫酸胺0.1 mL，TEMED 0.006mL，混合均匀，迅速灌注在两玻璃板的间隙中间，要留出灌注浓缩胶所需空间(梳子的齿长再加0.5 cm)，再在胶液面上小心注入一层水（约高2—3 mm），以阻止氧气进入凝胶溶液。②分离胶聚合完全后（约30 min），倾出覆盖水层，再用滤纸吸净残留水。③配制SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳浓缩胶溶液用去离子水2.7 mL，30%的丙烯酰胺0.67 mL，1.0 mol、pH 6.8的Tris缓冲液0.5 mL，10%的SDS0.041 mL，10%的过硫酸胺0.04 mL，TEMED 0.004 mL，混合均匀，直接灌注在聚合的分离胶上，并立即在浓缩胶溶液中插入干净的梳子。整个操作过程应注意避免气泡的产生。然后再补加浓缩胶溶液，使其充满梳子之间的空隙，将凝胶垂直放置于室温下聚合。 （1）根据厂家说明书安装电泳用的玻璃板 （2）SDS—聚丙烯酰胺凝胶制备： 3、电泳方法步骤 （3）样品处理：在电泳样品中按1∶1体积比加入样品处理液，在100 ℃温度下加热3 min，以使蛋白质变性。（4）浓缩胶聚合完全后（30 min），小心移出梳子。把凝胶固定于电泳装置上，上下槽各加入Tris—甘氨酸电泳缓冲液。必须设法排出凝胶底部两玻璃板之间的气泡。（5）加样：按顺序加样，加样量通常为10—25 μL。样品可以多加几个，例如，血浆样品红细胞破碎后(即进行凝胶色谱分离之前)的样品和凝胶色谱分离之后的样品（6）电泳：将电泳装置与电源相接，凝胶上所加电压为8 V/cm。当染料前沿进入分离胶后，把电压提高到15 V/cm，继续电泳直至溴酚蓝到达分离胶底部上方约1 cm处，关闭电源。（7）剥胶：从电泳装置上卸下玻璃板，用刮刀撬开玻璃板。将紧靠最左边一孔（第一槽）凝胶下部切去一角，以标注凝胶的方位。（8）染色：将电泳凝胶片放在考马斯亮蓝染色液中染色1-2 h。（9）脱色：染色完毕，倾出染色液,换脱色液脱色3-10 h，其间需多次更换脱色液至背景清楚。（10）观察结果：SDS电泳的成功关键之一是电泳过程中，待别是样品制备过程中蛋白质与SDS的结合程度。 3、电泳方法步骤 磁力搅拌器 搅拌器转子 搅拌器正在工作 3.分离血红蛋白溶液： 将搅拌好的混合溶液转移到离心管中，以2000r/mim的速度离心10mim后，可以看出溶液分为4层，从上往下数，第一层是无色透明的甲苯层，第二层为白色薄层固体，是脂溶性物质沉淀层，第三层为红色透明液体，这是血红蛋白的水溶液，第四层是其他杂质的暗红色沉淀物。将试管中的液体用滤纸过滤，出去脂溶性沉淀物，于分液漏斗中静置片刻后，分出下层的红色透明液体 （3）分离血红蛋白溶液： 用滤纸过滤，除去脂溶性沉淀层，于分液漏斗中静置片刻后，分出下层的红色透明液体。 甲苯层（无色透明） 白色薄层固体 红色透明液体 杂质沉淀层（暗红色） 试管中溶液层次 柜式离心机 4.透析： 取1mL的血红蛋白溶液装入透析袋中，将透析袋放入盛有300mL的物质的量浓度为20mmol/L的磷酸缓冲剂中（pH为7.0），透析12h。 2.粗分离透析（去除分子量较小的杂质） （1）用 方法进行粗分离，透析袋由半透膜制 成，常用 。将透析袋放入 溶液中进行透析。 （2）透析的原理是 （3）透析的目的是 。 透析 玻璃纸、肠衣、膀胱膜 透析袋能使小分子自由进出，而将大分子保留在袋内 去除样品中分子量较小的杂质 磷酸缓冲 透析过程中如何去除无机盐离子和小分子有机物？ 半透膜的选择透过性，大分子物质不能通过半透膜，离子和小分子能够通过半透膜。在透析过程中，血红蛋白溶液中的离子和小分子不断通过半透膜扩散进入到pH＝7的磷酸缓冲液中。 透析过程中为何使用pH＝7的磷酸缓冲液？为什么缓冲液量远多于血红蛋白溶液量？ 维持血红蛋白的正常特性。有利于杂质分子充分地向外扩散。 透析过程动画演示 （1）凝胶色谱柱的制作 ①取长40厘米，内径1.6厘米的玻璃管，两端需用砂纸磨平。 ②底塞的制作： 打孔 挖出凹穴 安装移液管头部 覆盖尼龙网，再用100目尼龙纱包好。 　3、纯化（凝胶色谱）去除相对分子量较大的杂质蛋白 凝胶