微生物实验四：微生物实验.pptVIP

细菌革兰氏染色及个体形态观察  一、目的要求 二、基本原理 革兰氏染色 酒精脱色时，G＋菌细胞壁厚，含有较厚的肽聚糖，又由于有短肽作肽桥且短肽几乎都相连，肽聚糖的强度高，整个细胞壁结构紧密，因此遇酒精时，结晶紫碘液阻留在细胞壁内； G－ 酒精使外膜类脂溶解，只剩肽聚糖层，而G－ 肽聚糖层薄而松散，不能阻挡复合物逸出，细胞壁变成无色， 再用红色染料复染，则G＋因已结合紫色染料难以吸咐红色染料，成紫色或结合微量红色染料而成紫红色。而G－ 菌则重新吸附红色染料由无色变红色。 三、实验材料 四、实验内容 2. 观察大肠杆菌、 枯草芽孢杆菌 、自接菌种的细胞形态，画图。 涂片 涂片 干燥、固定 先用吸水纸吸去部分水珠，菌面朝上，用酒精灯的外焰部分干燥。以手背面不感觉烫，看不到明显的液体为宜。 初染：滴加草酸铵结晶紫染液覆盖涂菌部位，染色1-2min 钟后倾去染液，水洗至流出水无色。 媒染：先用卢戈氏碘冲去水迹，再用碘液覆盖1min倾去碘液，水洗至流出水无色。 脱色 油镜观察 五、实验结果和思考题 1.绘出油镜下观察的三种菌株的图像，表明菌体的颜色，判断其革兰氏阳性还是阴性。 2.思考题 革兰氏染色是否成功有哪些问题需要注意，为什么？ * * 实 验 四 1、识别细菌的形态特征（观察细菌的形态、大小、色泽、透明度和边缘特征。 2、 掌握细菌涂片方法及革兰氏染色步骤， 并在显微镜下观察细菌的形态。 3.学习巩固显微镜操作技术及无菌操作技术 结晶紫、碘液媒染时，由于细胞壁带负电荷、吸收碱性染料， G＋ ， G－和都吸收碱性染料，在细胞结合结晶紫碘液复合物。 Staphylococcus aureus 金黄色葡萄球菌 Escherichia coli 大肠杆菌 革兰氏染色 示意图 步骤 G＋菌 G－菌 1. 固定 2. 结晶紫 3. 碘液 5. 沙黄 4. 脱色 杂色 文字 阳性菌 阴性菌 革兰氏染色法 （一）药品 生理盐水 结晶紫染液 卢戈氏碘液 95%乙醇 蕃红（复红） 香柏油 二甲苯 （二）菌种 枯草芽孢杆菌 大肠杆菌 第一大组自制菌种 （三）其它物品 显微镜 擦镜纸 载玻片 吸水纸 盖玻片 1. 大肠杆菌、 枯草芽孢杆菌、自接菌种（可疑细菌）革兰 氏染色。 涂片、干燥、固定——结晶紫初染1分钟，水洗—碘液 （媒染）冲去残水并覆盖1分钟，水洗——95%的乙醇脱色 30秒，水洗——蕃红复染1-2分钟，水洗——干燥，油镜观察 前进 红色 G－菌 红色 G+菌 在载玻片的一角贴上标签纸，写上菌株的名称。在中间滴一滴生理盐水，用无菌环，无菌操作分别由枯草芽孢杆菌、大肠杆菌，自制平板上挑取适量的菌苔，将沾有菌苔的接种环置于载玻片上的生理盐水中涂抹，使菌悬液在载玻片上形成均匀薄膜。若是液体培养物图片，可用接种环蘸取1-2环直接涂于载玻片上。 活跃生长期的幼培养物 老龄培养物结构松弛，G+——G- 涂片不可过厚，以免脱色不全，造成假阳性，也妨碍观察菌体的形态 将玻片上残留水用吸水纸吸去，用95%乙醇脱色30s。 脱色不足：阴性菌误染成阳性菌 脱色过度：阳性菌误染成阴性菌 1)转动转换器将油镜转至镜筒正下方。在标本镜检部位滴上一滴香柏油。慢慢转动粗调螺旋，使载物台上升，并及时从侧面注视使物镜浸入油中，直到几乎与标本接触时为止(注意切勿压到标本，以免压碎玻片，甚至损坏油镜头)。2) 左眼看目镜，微微转动粗调螺旋，下降载物台(注意：此时只准下降载物台，不能向上调动)，当视野中有模糊的标本物象时，改用细调螺旋，并移动标本直至标本物象清晰为止。3) 如果镜头已离开油滴又尚未发现标本时，可重新按上述步骤操作直到看清物象为止。