实验二.PCR及电泳.pptVIP

实验二：PCR反应与电泳 一、实验目的 掌握PCR反应和核苷酸电泳的原理、步骤及注意事项。 二、实验内容 以实验一所取得的一链cDNA为模板，设计引物进行PCR反应，然后对反应产物进行电泳分析。 三、实验药剂及仪器 DNA聚合酶、引物、dNTP、灭菌水、电泳缓冲液、琼脂糖、marker、EB；PCR仪、离心机、凝胶成像系统、核酸电泳仪。 四、实验结果 根据引物的设计，本实验预计PCR合成的片段大小为861bp PCR反应步骤 25μl体系 在PCR管中依次混匀下列试剂： 10 ? PCR反应缓冲液（含MgCl2） 2.5μl dNTP 2μl 上游引物 1μl 下游引物 1μl 模板DNA 2μl H2O 16.3μl Taq酶 0.2 μl PCR仪程序设定： 94℃ 4min 94℃ 45s 55℃ 30s 72℃ 1min 72℃ 8min PCR注意事项: PCR反应极为灵敏，为了防止污染，应注意无菌操作； 每加一种试剂后应更换移液枪头，避免交叉污染试剂； 应设含除模板DNA外所有其它成分的负对照，以明确整个实验是否有污染。 电泳步骤 制胶 称取0.25 g琼脂糖，置于100 ml三角烧瓶中，加入25 ml的0.5?TBE（TAE）缓冲液，放入微波炉中加热至琼脂糖全部融化，取出摇匀，冷却至60-70?C（加入2.5ul的溴化乙锭，摇匀）。 将冷却至50～60?C的琼脂糖胶液倒入胶槽中，使胶液形成均匀的胶层，注意观察胶面有否气泡，如有则用移液枪头赶掉。 插上样品梳子，注意梳子齿下端应与胶槽低面保持一定的距离。 加样 琼脂糖胶完全凝固后，拔出梳子，注意不要损坏梳子底部的凝胶。 将琼脂糖胶连同胶槽一起放入电泳槽中，并向电泳槽中加入0.5?TBE缓冲液，直至缓冲液没过胶面。 取实验1中的PCR反应产物5～10 ml加2 ml 6?上样液混匀，用移液枪小心加入样品槽。 注意要小心操作，避免损坏凝胶或将样品槽底部刺破。分子量标记单独加在一个样品槽中。 电泳 加样完后，合上电泳槽盖，接通电源。 控制电压保持在60～80V（依据电泳槽的长度），电流在40mA以上。 当溴酚蓝条带移动到距凝胶前沿约2 cm时，停止电泳。 染色与观察 电泳结束后，从胶槽中取出凝胶，放入凝胶成像系统中。 在凝胶成像系统的波长254nm紫外灯下观察染色后的电泳凝胶。DNA存在处显示出可见的桔红色荧光条带，并保存图像。 注意染色后的凝胶有EB，操作时要戴手套；紫外灯下观察时应戴上防护眼镜，以免损伤眼睛。 电泳注意事项： 紫外线对DNA有切割作用，因此如要从胶上回收DNA片段时，应使用长波长的紫外灯（300～360nm），以减少紫外线对DNA的切割。 EB是强诱变剂，具中等毒性，配置和使用时均应戴手套，而且要小心操作，避免将EB液洒到桌面或地面。污染有EB的物品、容器必须经过专门处理才可清洗或丢弃。 当EB溶液浓度过高、胶染色过深、DNA条带看不清时，可将胶用蒸馏水脱色30～60 min后再观察。 * 32 cycles 变性 退火 延伸 *