柔嫩艾美耳球虫抗药性相关基因M20的克隆及检测方法的建立研究.pdfVIP

Sitv ．， anddetectionof Cloning drug——resistance ofEimeriatenella Me0 gene FACULTY： ofLifeandEnvironmental College Sciences MAJOR：Zoology DIRECTION： biotechnology Zoological AUTHoR：CHENGJun SUPERVISOR：HUANGProfessor Bing DATE： March，2011 l————一摘要 论文题目 ：柔嫩艾美耳球虫抗药性相关基因M20的克隆及检测方法的建立 专 业：动物学 学位申请人：程军 指导教师：黄兵研究员 鸡球虫病是由寄生在鸡肠道上皮细胞内的艾美耳球虫引起的一种寄生性原 虫病，多危害15-50日龄的雏鸡，死亡率很高，该病分布广泛，危害极其严重， 目前仍以药物防治为主。由于长期不规范地药物使用，导致抗药株的普遍产生。 至今已从养鸡场中分离出几乎对所有使用过抗球虫药具有抗药性的虫株，且抗药 性产生的时间缩短、程度日趋严重，由单一的抗性变为多重的、交叉的抗性，抗 药性已经成为球虫病防治中遇到的最严重的问题，但其产生的机制尚不清楚。对 控制某一特定药物抗药性基因的检测，可以监测抗药性的蔓延并增加指导用药策 略的有效性。 本研究室前期构建了柔嫩艾美耳球虫(Eimeriatenella)地克珠利抗药株和马 杜拉霉素抗药株与各自母株之间的抑制性消减文库，利用RACE技术获得了一 些与抗药性相关基因的全长序列。本研究选择其中的M20新基因进行了克隆与原 核表达，建立了针对M20基因的实时荧光定量PCR方法用于检测柔嫩艾美耳球 虫的抗药性，并用鸡体药物敏感试验对定量PCR结果进行了验证。 1．球虫抗药性相关基因M20的克隆及表达 根据EST序列设计引物，扩增获得了与抗药性相关的新基因M20，其全长 cDNA序列为847 bp，包括一个525bp的开放阅读框，编码174个氨基酸，理论 分子量约为19 KDa。其编码的蛋白与刚地弓形虫(Toxoplasmagondii)的胰岛 素降解酶在31--477位氨基酸间具有45％的同源性。该基因在未孢子化卵囊阶段 的表达量最高，而在裂殖子阶段和子孢子阶段几乎没有表达。将获得的M20全长 并且利用大肠杆菌BL21(DE3)诱导表达出该重组蛋白，但以包涵体形式存在。 Westemblot检测，该蛋白还具有一定的免疫原性。 2．Real-Time PCR检测柔嫩艾美耳球虫抗药性方法的建立 为建立简单、快速的球虫耐药性检测方法，根据M20基因序列设计特异性引 物，分别建立了SYBR Probe法的Real．TimePCR方法。结 Green法和TaqMan 果显示，两种方法均具有良好的特异性和重复性。选择操作简单、成本较低的 SYBR Green法对已知具有抗性的地克珠利抗药株、马杜拉霉素抗药株以及对药 物敏感的母株之