水稻蛋白激酶高通量克隆表达及初步活性研究.pdfVIP

Y933716 分类号：Q2墨§ 单位代码：!QQ昼鱼 密 级：垒珏 水稻蛋白激酶高通量克隆表达 及初步活性分析 The and highthroughputcloning，expressionpreliminary ofrice kinases enzymeactivityanalysisprotein 学位申请人：孙健 指导教师：刘国振教授 学科专业：植物学 学位类别：理学硕士 授予单位：河北农业大学 答辩日期：二oo六年六月十日 摘要 水稻是世界上重要的粮食作物之一，是研究作物产量、转基因、杂种优势、病虫 害抗性和其它抗逆等方面的重要遗传材料，也是基础研究的模式植物之一。水稻中有 1500个以上的蛋白激酶，作为催化调节翻译后修饰的最大酶类，在水稻生长发育的 所有过程中发挥着重要作用。但目前真正了解功能的水稻激酶屈指可数。 蛋白激酶的克隆与表达往往是了解其功能的首要步骤。以往的基因克隆方法如图 位克隆法、转座子标签法等大都是建立在正向遗传学的基础上，这些方法只适用于一 个或少数基因，应该说是零敲碎打的策略。水稻基因组测序的完成为在基因组水平上 开展水稻激酶功能研究提供了必要条件，也为大规模的克隆水稻激酶基因提供了可 能。 本试验根据反向遗传学原理，利用己公布的水稻蛋白激酶序列设计引物，用P(’R 方法扩增水稻蛋白激酶的编码序列，再利用酵母的同源重组系统，将激酶基因克隆到 酵母表达载体pEGH上，经验证后将含有重组子的克隆进行诱导，表达激酶蛋白质， 并对表达的激酶进行了初步活性分析。通过对试验结果的分析，得出以下结论： 在本试验中，为了使水稻蛋白激酶能在体外进行表达，对水稻的激酶序列进行分 析后，选取了基因内部不含内元，以及不含跨膜结构的激酶序列设计引物，共设计并 合成了水稻激酶特异性引物30对；利用PCR反应得到了26个水稻蛋白激酶的编码 序列；为了提高同源重组的效率，降低引物合成的成本，试验采用两次PCR方法使 重组位点达到50bp，明显提高了转化效率；利用酵母的同源重组系统将这26个PCR 产物转入酵母，最终23个发生了重组；以半乳糖为诱导物进行诱导，这23个激酶在 酵母中都有不同程度的表达；此外，本试验还对这23个激酶蛋白质进行了初步活性 分析，其中9个有自我磷酸化活性。 这些工作的完成为抗体制备、激酶底物的筛选等研究奠定了基础，也为高通量克 隆表达水稻蛋白建立了一个有效的系统。本试验建立的规模化克隆与表达水稻蛋白激 酶的技术体系，也为其它功能基因的大规模研究提供了参考。 关键词：水稻；蛋白激酶；同源重组；克隆；表达；自我磷酸化 The and highthroughputcloning，expressionpreliminary ofrice kinases activityanalysisprotein enzyme Au山or：SUNJian Guozhen Supervisor：LIU Major：Botany Abstract an food isan material