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生物秀实验频道——生命科学实验中心 ！  /bio101/  ELISA 技术的操作要点 E L I S A 技 术 的 操 作 要 点 优质的试剂，良好的仪器和正确的操作是保证 ELISA 检测结果准确可靠的必要条件。  ELISA 的操作因固相载体的形成不同而有所差异，国内医学检验一般均用板式点。本文将叙 述板式 ELISA 各个操作步骤的注意要点，珠式、管式及磁性球 ELSIA ，国外试剂均与特殊 仪器配合应用，两者均有详细的使用说明，严格遵照规定操作，必能得出准确的结果。  4.1 标本的采取和保存 可用作  ELISA 测定的标本十分广泛，体液 （如血清）、分泌物 （唾液）和排泄物 （如尿 液、粪便）等均可作标本以测定其中某种抗体或抗原成份。有些标本可直接进行测定（如血 清、尿液），有些则需经预处理（如粪便和某些分泌物）。大部分  ELISA 检测均以血清为标 本。血浆中除尚含有纤维蛋白原和抗凝剂外，其他成份均同等于血清。制备血浆标本需借助 于抗凝剂，而血清标本只要待血清自然凝固、血块收缩后即可取得。除特殊情况外，在医学 检验中均以血清作为检测标本。在 ELISA 中血浆和血清可同等应用。 血清标本可按常规方法采集，应注意避免溶血，红细胞溶解时会释放出具有过氧化物酶活性 的物质，以 HRP 为标记的 ELISA 测定中，溶血标本可能会增加非特异性显色。 血清标本宜在新鲜时检测。如有细菌污染，菌体中可能含有内源性 HRP ，也会产生假 阳性反应。如在冰箱中保存过久，其中的可发生聚合，在间接法 ELISA 中可使本底加深。 一般说来，在 5 天内测定的血清标本可放置于 4℃，超过一周测定的需低温冰存。冻结血清 融解后，蛋白质局部浓缩，分布不均，应充分混匀宜轻缓，避免气泡，可上下颠倒混和， 不要在混匀器上强烈振荡。混浊或有沉淀的血清标本应先离心或过滤，澄清后再检测。反 复冻融会使抗体效价跌落，所以测抗体的血清标本如需保存作多次检测，宜少量分装冰 存。保存血清自采集时就应注意无菌操作，也可加入适当防腐剂。  4.2 试剂的准备 按试剂盒说明书的要求准备实验中需用的试剂。  ELISA 中用的蒸馏水或去离子水，包 括用于洗涤的，应为新鲜的和高质量的。 自配的缓冲液应用 pH 计测量较正。从冰箱中取出 的试验用试剂应待温度与室温平衡后使用。试剂盒中本次试验不需用的部分应及时放回冰箱 保存。  4.3 加样 在  ELISA 中一般有 3 次加样步聚，即加标本，加酶结合物，加底物。加样时应将所加 物加在 LEISA 板孔的底部，避免加在孔壁上部，并注意不可溅出，不可产生气泡。 加标本一般用微量加样器，按规定的量加入板孔中。每次加标本应更换吸嘴，以免发生 交叉污染，也可用一次性的定量塑料管加样。有此测定（如间接法  ELISA ）需用稀释的血 清，可在试管中按规定的稀释度稀释后再加样。也可在板孔中加入稀释液，再在其中加入血 清标本，然后在微型震荡器上震荡 1 分钟以保证混和。加酶结合物应用液和底物应用液时可 用定量多道加液器，使加液过程迅速完成。  4.4 保温 在  ELISA 中一般有两次抗原抗体反应，即加标本和加酶结合物后。抗原抗体反应的完 成需要有一定的温度和时间，这一保温过程称为温育(incubation)  ，有人称之为孵育，在 生物秀论坛——资源共享、学术交流、互助社区  1  /bbs/  生物秀实验频道——生命科学实验中心 ！  /bio101/  ELISA 中似不恰当。  ELISA 属固相免疫测定， 抗原、 抗体的结合只在固相表面上发生。 以抗体包被的夹心法为例， 加入板孔中的标本，其中的抗原并不是都有均等的和固相抗结合的机会，只有最贴近孔壁的 一层溶液中的抗原直接与抗体接触。这是一个逐步平衡的过程，因此需经扩散才能达到反应 的终点。在其后加入的酶标记抗体与固相抗原的结合也同样如此。这就是为什么  ELISA 反 应总是需要一定时间的温育。温育常采用的温度有  43℃、37℃、室温和 4℃ （冰箱温度）等。  37℃是实验室中常用的保温温度，也是大多数抗原抗体结合的合适温度。在建立 ELI SA 方 法作反应