人B淋巴细胞活化相关基因克隆及其功能初探.pdf

——一!旦塑塑垦型查堂堕主堂垡造壅 静止B细胞中高表达的EST相对应基因的全长。随后进行基因和蛋白序列的分析；最 后，对基因的功能进行初步的研究。 通过上述研究策略和路线的实旌，本工作获得以下研究结果： 1．获得7条新的、在活化和静止B细胞中差异表达的EST片段 我们在前期应用DDRT—PCR方法，比较人扁桃体静止B细胞和活化B细胞中的 基因表达差异，所获得的62条EST中，选择出差异显著的25条差异显示带作为探针， 阳性，且与差异显示谱的结果基本一致。经序列同源性分析，其中5条EST与己知 获得Gell_Bank接受号。 2．活化B细胞差异表达的基因全长的克隆与序列分析 由于EST多数都代表了基因的3’端的序列，为获得基因的全长，我们首先采用了 经典的筛选cDNA文库的方法：选择在活化B细胞中高表达的4条EST作为混合探 针，筛选人活化B细胞cDNA文库，得到两条新的全长cDNA克隆。其中一个克隆 同源性较高的基因。应用SBASE分析该蛋白N端98个氨基酸残基与酵母的动力蛋 无任何的同源。 基与人o2．。肾上腺素受体在氨基酸水平上有25％的同源性。究竟这两条基因在B细 胞活化中如何起作用，还有待于进一步的研究。 3．静止B细胞差异表达的基因BC．2028的eDNA的克隆与序列分析 近年来，随着人类基因组计划(HGP)在世界范围内的开展，大量的生物学数据 不断增加，使得基因的“电子克隆”成为可能。因而我们采用生物信息学的方法，通 ．2． ——一． !璺堡塑匡型盔堂竖主兰鱼鲨壅 过互联网，利用公共数据库中已有的信息，对静止B细胞中高表达的EST进行EST 的相似性。经PSORTll分析，该蛋白产物主要分布于细胞核。检索Pfam数据库发现， 该序列羧基端含有典型的7个连续的c2H2型锌指蛋白结构域。另外，在锌指蛋白结 种重要的转录调节因子广泛地存在于哺乳动物细胞中，对于细胞的生长、分化以及发 育和肿瘤的发生等许多生理过程中起重要的调节作用。这提示了BC一2028可能在B 细胞活化的过程中起着重要的调节作用。我们接下来的工作也主要围绕该基因展开。 4，基因BC-2028的功能初探 1)BC一2028组织表达谱以及在B细胞的不同活化阶段的表达分析。通过多组织 细胞系中均有表达；而在胸腺以及T细胞来源的MOLT-4细胞中不表达。另外发现， 在胚胎相应的组织中BC．2028表达量明显降低；在肿瘤细胞中也呈弱表达的趋势。 预示着BC一2028基因可能与发育以及肿瘤的发生有关。B细胞不同活化阶段的 活化程度的增加，其表达量依次降低。说明BC一028基因的表达可能与B细胞的活化 有关。 功能，我们将其编码区克隆到原核表达载体pET42a(+)载体中，构建了原核表达载体 导表达的融合蛋白主要以可溶性形式存在于培养上清中。选用亲和层析的方法对融合 蛋白进行纯化。纯化后的蛋白纯度为97．8％，可用于多克隆抗体的制备。 ．1． 生里堡塑垦型盔芏蔓主堂焦堡苎 3)BC-2028基因产物在细胞中的定位观察。将BC．2028 载体上，使得基因BC．2028的表达产物与绿色荧光蛋白以融合蛋白的形式在哺乳动 物细胞中表达。通过检测绿色荧光蛋白所在的位置，从而可以得到目的基因表达定位 将细胞置于倒置显微镜下观察。结果表明：该基因的表达产物多位于细胞核区域。 普遍存在的一类DNA结合蛋白，在真核细胞的基因调控中起着关键的作用。而 转录调节作用，我们在哺乳动物细胞双杂交系统的基础上并适当加以改进来对此进行 结合位点的报告基因质粒共转染CHO细胞，通过检测报告基因的表达量可知， 、，／ BC．2028具有明显抑制基因表达的作用。、 I 能进行了初步探索，为深入研究该基因在B细胞活化中的作用奠定了基础。 活御，基因，克隆 ＼二， ／＼ f ＼ l ——————————————————j生塑堕登盔堂堕主堂垡堡塞 an