12DNA的琼脂糖凝胶电泳分析.pptVIP

分子生物学基本技术 DNA 的 琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 三峡大学医学院生物化学教研室凝胶电泳 凝胶电泳凝胶电泳:由琼脂、琼脂糖、淀粉胶及聚丙烯凝胶电泳:由琼脂、琼脂糖、淀粉胶及聚丙烯 酰胺等物质作支持体的电泳。 酰胺等物质作支持体的电泳。特点:特点: 1. 可以制成非常均匀的凝胶,带电质点在凝胶 1. 可以制成非常均匀的凝胶,带电质点在凝胶 的孔中泳动。 的孔中泳动。 2. 操作方法简便,电泳速度快。 2. 操作方法简便,电泳速度快。 3. 分辨率高,重复性好,电泳图谱清晰。 3. 分辨率高,重复性好,电泳图谱清晰。 4. 适用于生化、免疫等定性定量测定。 4. 适用于生化、免疫等定性定量测定。 琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳是分离鉴定和纯化DNA片段的标 准方法。该技术操作简便快速,可以分辨用其它方法(如 密度梯度离心法)所无法分离的DNA片段。当用低浓度的荧光嵌入染料溴化乙啶Ethidium bromide, EB染色,在紫外光下至少可以检出1- 10ng的DNA条带,从而可以确定DNA片段在凝胶中 的位置。此外,还可以从电泳后的凝胶中回收特定的DNA条 带,用于以后的克隆操作。琼脂糖凝胶 琼脂糖凝胶 天然琼脂(agar):又名琼胶、菜燕、冻粉从石花菜及其它红藻类植物提取出来的一种 线状高聚物。 琼脂糖(agarose) 琼 脂 琼脂胶(agaropectin):含硫酸根和羧基的强酸 性多糖,在电场作用下能产生较强的电渗现象。? 琼脂糖 ?琼脂糖是由琼脂中提取出来的,D-半乳糖 和3、6-脱水-L-半乳糖结合的链状多糖。 ?中性物质,不带电荷 3,6-脱水-L-半乳糖 3,6-脱水-L-半乳糖 D-半乳糖 D-半乳糖 琼脂糖链依 琼脂糖链依分子内和分子间氢键 分子内和分子间氢键及其它力的作用 及其它力的作用使其互相盘绕形成绳状琼脂糖束,构成大网孔型凝胶。 使其互相盘绕形成绳状琼脂糖束,构成大网孔型凝胶。 琼脂糖凝胶的优点 琼脂糖凝胶的优点 1 操作简单,电泳速度快,样品不需事先处 理就可进行电泳。 2琼脂糖凝胶结构均匀,对样品吸附极微, 因此电泳图谱清晰,分辨率高,重复性好。 3琼脂糖透明无紫外吸收,电泳过程和结果 可直接用紫外监测及定量分析。 4电泳后区带易染色,样品易洗脱,便于定 量测定。制成干膜可长期保存。缺点: 缺点: 1.机械强度差,易破碎,浓度不能太低。 1.机械强度差,易破碎,浓度不能太低。 2.易被细菌污染,不易保存,临用前配制。 2.易被细菌污染,不易保存,临用前配制。 3.琼脂糖支持层上的区带易于扩散,电泳后 3.琼脂糖支持层上的区带易于扩散,电泳后 必须立即固定染色。 必须立即固定染色。 4.与PAGE相比,分子筛作用小,区带少。 4.与PAGE相比,分子筛作用小,区带少。 影响琼脂糖凝胶电泳的因素DNA分子的大小:实验证明, DNA片段迁移距离与其分子量 的对数成反比;琼脂糖的浓度:一定大小的 DNA片段在不同浓度的琼脂凝 胶中,电泳迁移率不相同;DNA分子的构型:不同构型的 DNA在琼脂糖凝胶中的电泳速 度差别较大。琼脂糖凝胶浓度与可分辨的DNA大小范围的关系 琼脂糖凝胶浓度/% 可分辨的线性DNA大小范围/kb 0.3 60~5 0.6 20~1 0.7 10~0.8 0.9 7~0.5 1.2 6~0.4 1.5 4~0.2 2.0 3~0.1核酸构型与琼脂糖凝胶电泳分离的关系在分子量相当的情况下,不同构型的 DNA的移动速度次序如下: ?共价闭环DNA covalently closed circular,简称cccDNA直线DNA 开环的双链环状DNA。 质粒同一种质粒,由于其构象不同,电泳时的迁 移率也不同。常会出现两条或三条电泳带一条是超螺旋质粒DNA的带,移动速度最快;另一条是(松弛)螺旋状质粒DNA带(开环质粒 DNA),移动速度最慢。有时因为有一些质粒DNA在提取过程中遭到损伤而 线性化(线状质粒DNA),其移动速度介于螺旋状 和超螺旋状质粒DNA之间。质粒 Relaxed circle Linearized form Super-coiled form?离子强度影响 电泳缓冲液的组成及其离子强度影响DNA的电 泳迁移率。 ?在没有离子存在时如误用蒸馏水配制凝胶,电 导率最小,DNA几乎不移动; ?在高离子强度的缓冲液中如误加10×电泳缓冲 液,则电导很高并明显产热, 严重时会引起凝 胶熔化或DNA变性。电泳缓冲液 常用三种缓冲液 ? Tris-硼酸(TBE) ? Tris-乙酸(TAE) ? Tris-磷酸(TPE)Tris(三羟甲基氨基甲烷):是一种生物碱,常用 于生物实验中配制各种pH值的缓冲液。1M的Tris溶 液的pH值大约是10~11。EDTA 可