奶牛白介素-18基因的表达、单克隆抗体的制备及初步鉴定.pptVIP

牛白介素-18成熟蛋白基因表达及生物学活性测定 山东农业大学 田兆菊 指 导 教 师 赵宏坤 教授 汇报内容 牛白介素18研究的目的意义 研究现状 试验一 BoIL-18在大肠杆菌中的表达及 生物学活性测定 试验二 BoIL-18在昆虫杆状病毒表达载体 中的表达及生物学活性测定  研究的目的意义（一） 细胞因子(cytokines)是强有力的蛋白性调节因子,可以调节免疫反应、炎症反应、组织修复、组织移植和造血等。 近年来，重组细胞因子已在一些动物疾病预防、免疫治疗和构建新一代基因工程苗等方面显示出了广阔的应用前景  白细胞介素18（ Interleukin-18 , IL-18）是近年发现的一种多功能免疫调节蛋白,它在先天及后天的免疫应答调节中起重要作用。 研究表明,IL-18能诱导产生IFN-γ。人类医学研究已经证明了IL-18在抗微生物感染,尤其是在抗肿瘤免疫方面具有潜在的应用价值。 研 究 现 状 牛白细胞介素18（ Bovine Interleukin-18 , BoIL-18）的研究相对滞后，1999年, shoda等首次获得了BoIL-18基因。 目前，国内对BoIL-18的研究还属于起步阶段, 但不容否认的是，BoIL-18的基因及其编码蛋白在免疫学研究以及奶牛疾病防治中具有重要意义, 有望成为一种新型生物制剂。 试 验 一 BoIL-18基因在原核表达载体中的表达及生物学活性测定  制备牛PBMC，接种于96孔细胞培养板 分组 空白组 RPMI 1640 对照组 Con A BoIL-18组：不同浓度 GST组：不同浓度 培养 MTT 培养 DMSO 读取OD570值 结果及分析 PI SPSS软件  用双抗体夹心ELISA法测定 制备脾淋巴细胞，接种于细胞培养板 分组 空白组 RPMI1640 阴性对照组 不同浓度的GST蛋白 BoIL-18蛋白组 不同浓度的BoIL-18融合蛋白 培养 取培养上清检测ELISA抗体 结果判定 OD450值 P/N≥2.1为阳性 结 果（一） 重组表达质粒的鉴定 结 果（二） DNA测序 TCCCCGGAATTCCCGGGTCGACCAGATTATACCATGGATCACTTTGGCAAACTTGAACCTAAGCTCTCAATCATACGAAATCTGAACGACCAAGTTCTCTTCATTAGCCAGGGAAATCAACCTGTCTTTGAGGATATGCCTGATTCTGACTGTTCAGATAATGCACCCCAGACCATATTTATCATATATATGTATAAGGACAGCCTCACTAGAGGTCTGGCTGTAACCATCTCTGTGCAGTGTAAGAAAATGTCTACTCTCTCCTGTGAGAACAAAATTATTTCCTTTAAGGAAATGAATCCTCCTGATAACATTGATAATGAAGGAAGTGACATCATATTCTTTCAGAGAAGTGTTCCAGGACATGATGATAAGATACAATTTGAGTCTTCATTGTACAAAGGGTACTTTCTAGCTTGTAAAAAAGAGAATGACCTTTTCAAACTCATTTTGAAAAGACAGGATGATAATAGAGATAAATCTGTAATGTTCACTGTTCAAAACCAGAACTAGGCGGCCGCATCGTGACTGA ? 结 果（三） BoIL-18融合蛋白的表达及纯化 pGEX6p-1-BoIL-18在BL21中表达 结 果（四） BoIL-18融合蛋白的Western blot分析 结 果（五） BoIL-18融合蛋白对PBMC的增殖 同浓度的BoIL-18与GST蛋白比较，除浓度为0.05mg/L时差异不显著外，其它浓度均差异显著或差异极显著 不同浓度的GST对PBMC均没有增殖作用 BoIL-18蛋白对PBMC均有增殖作用，并且随着浓度的增加，增殖指数增大 结 果（六） BoIL-18融合蛋白