紫花苜蓿离体培育植株再生及其rapd 分析.pdfVIP

维普资讯 第 l5卷 第 5期 蕈 业 学 报 U 5一 l2l Vo1．15．No．5 ACTA PRATACULTURAE SlNlCA 10／2006 紫花苜蓿离体培养植株再生及其 RAPD分析 刘青芳，步怀宇，赵宇玮 ，贾敬芬 (西北大学生命科学学 院。陕西 西安 710069) 摘要 ：对苜蓿(品种农宝)的下胚轴外植体进行离体培养建立 了再生体系。结果表 明．子叶和下胚轴切段在附加 0．2 ～ 1．0mg／LIAA和2．0mg／L6-BA或 2．0mg／LKT的MS培养基上培养 ．均能诱导出愈伤组织 ．但子叶所诱导 的愈伤组织不具有分化能力。下胚轴切段培养 5～7d即可诱导出愈伤组织 ．并分化 出绿色芽点．在原培养基上进 而可分化出大量 的丛生芽 。在含 0．2mg／LIAA和2．0mg／L6-BA的MS培养基上 ．其分化率最高可达到42．6 。 这些芽在含 0．2mg／LIAA和 0．5mg／LKT的MS培养基上长成 2cm左右的幼苗时 ·将其切下转至 1／zMSo培 养基上 ．培养 10d即可诱导生根 ．得到再生植株 。随机选取实生苗和下胚轴愈伤组织再生苗进行 RAPD分析 ．结 果表明。所用的5O个随机引物中有 5个扩增出差异性条带，甚至再生植株之间也有 1条引物扩增的条带有差异 · 这说明经组织培养所得到的再生植株与实生苗相 比。在 DNA水平上发生了一定程度变异。并且这种变异也存在于 再生植株之间。 关键词 ：紫花苜蓿 ；子叶；下胚轴 ；再生植株 ；RAPD 中图分类号：$55l．904．8；Q944．3 l 文献标识码 ：A 文章编号：1004—5759(2006)05—0115—07 紫花苜蓿 (Medicagosativa)是世界上栽培历史悠久 ，生长面积最大 ，利用价值最高的优质豆科牧草。在我 国种植面积约 133万 hm。[，主要分布在西北和华北地区。其营养丰富，蛋 白质含量 占其干重的 179，6～2O9，6，是 多种畜禽喜食的优质蛋 白饲料 。利用基因工程技术来提高苜蓿抗寒、抗旱、耐盐碱能力以及改良其营养品质已成 为当今世界苜蓿发展和研究的新趋势和重点乜]。作为转基因受体，其再生体系仍存在着分化率低、重复性差、 受品种限制性强等问题 。而体细胞无性系变异即由于组织培养而发生在再生植株上的变异 ，作为植物组织 培养中经常发生的事件 ，也为众多研究者所关注[6]。RAPD(RandomAmplifiedPolymorphicDNA)作为一种 分子标记 ]，具有比其他 DNA技术简单易行，经济快速等优点n ，对 DNA多态性检测效率高，可随寡聚核苷酸 引物结合位点的频率而有效地对基因组进行差异分析 。因此，已成为用于分析经组织培养过程中变异的有效工 具 m：。 本实验以西北地区广泛种植的苜蓿品种农宝为材料，建立离体再生体系，并随机抽取实生苗和再生苗进行 RAPD分析，对组培过程中再生植株的变异作了初步的分子检测，为后一步外源基因在苜蓿细胞中的导人和表达 奠定了基础D33。 1 材料与方法 1．1 植物材料 所用的苜蓿品种为农宝，将其种子用 7O9，6乙醇浸泡 10min，然后用0．19，6HgCI水溶液灭菌 15min，无菌蒸 馏水清洗 5次 ，然后接种于附加 3％蔗糖 、0．65％琼脂粉 、不含任何外源激素的 MS培养基 (即MS。)上，在 25℃、2000lx光照条件下培养 。 1．2 愈伤组织的诱导及芽的分化 取生长5～7d子叶完全展开但真叶还未长出的苜蓿无菌苗，将其子叶切成 0．3cm宽的小块，下胚轴切成 0．5cm长的切段 ，接种于含 IAA和 KT或 6一BA不 同激素组合 的MS固体培养基 (表 1)上进行愈伤组织诱导。 收稿 日期：2005—10—27 基金项 目：陕西省 自然科学研究计划项 目(2004C110)；陕西省教育厅专项科研基金(JH04230)资助。 作者简介：刘青芳 (1980一