蛋白质核酸沉淀分离技术.pptVIP

沉淀分离技术 Salting-in 蛋白质和酶均易溶于水，分子中的－COOH、－NH2和－OH等亲水基团，与极性水分子相互作用形成水化层，包围于蛋白质分子周围形成亲水胶体，削弱了蛋白质分子之间的作用力，蛋白质分子表面极性基团越多，水化层越厚，蛋白质分子与溶剂分子之间的亲和力越大，因而溶解度也越大。 蛋白质聚集沉淀 选用盐析用盐的几点考虑： 盐析作用要强 盐析用盐需有较大的溶解度 盐析用盐必须是惰性的 来源丰富、经济 阴离子： 柠檬酸根-3酒石酸根-3 F-I03-H2P04-S04-CH3C00-Cl-Cl03-Br-N03-Cl04-I-CNS- 阳离子： Th4+Al3+H+Ba2+Sr2+Ca2+Cs+ Rb+NH4+K+Na+Li+ 常用于蛋白质沉淀的盐为硫酸铵和硫酸钠。硫酸钠虽无腐蚀性但低于400C就不易溶解，因此只适用于热稳定性较好的蛋白质的沉淀过程。 （1）溶解度大 （2）分离效果好 （3）不易引起变性，有稳定酶与蛋白质结构的作用。 （4）价格便宜，废液不污染环境。 优点 硫酸铵浓度变化连续，盐析效果较好。 缺点 硫酸铵饱和度的测定、计算工作手续繁琐，而且透析袋容积有限、盐析速度慢、硫酸铵耗费大。 1）注意饱和度表中规定的温度； 2）分段盐析中，应考虑每次分段后蛋白质浓度的变化； 3）盐析后一般放置半小时至一小时，待沉淀完全后才过滤或离心； 4）加入硫酸铵时应注意搅拌，避免局部过浓； 5）硫酸铵使用前须用H2S处理，高浓度的硫酸铵溶液使用前需用氨水或硫酸调节至所需pH。 蛋白质等电点沉淀法是基于不同蛋白质离子具有不同等电点这一特性，依次改变溶液pH值的办法，将杂蛋白沉淀除去，最后获得目标产物。 （1）适用于疏水性强的蛋白质 （2）中性盐浓度增大时，等电点向偏酸方向移动，同时最低溶解度会有所增大。 （3）无机酸通常价格便宜，无毒 （4）蛋白质对低pH 敏感，易失活 加入溶剂后会使水溶液的介电常数降低，而使蛋白质分子间的静电引力增大，导致凝集和沉淀。 蛋白质的溶剂化，使原来和蛋白质结合的水被溶剂所取代，从而降低了它们的溶解度。 有机溶剂可能破坏了蛋白质的某种键如氢键，使其空间结构发生某种程度的变化，致使一些原来包在内部的疏水基团暴露于表面并与有机溶剂的疏水基团结合形成疏水层，从而使蛋白质沉淀。 聚电解质是含有重复离子化基团的水溶性聚合物，可用于蛋白质沉淀的聚电解质有聚丙烯酸、聚乙烯亚胺、羧甲基纤维素和离子型多糖如肝素等。 能与羧基、胺基等含氮化合物以及含氮杂环化合物强烈结合的金属离子，如：Mn2+、Fe2+、Co2+、Ni2+、Cu2+、Zn2+、Cd2+； 能与羧酸结合而不与含氮化合物结合的金属离子，如：Ca2+、Ba2+、Mg2+、Pb2+； 与巯基化合物强烈结合的金属离子，如：Hg2+、Ag+、Pb2+。 沉淀法应用 三、有机溶剂沉淀法 许多能与水互溶的有机溶剂如乙醇、丙酮、甲醇和乙腈，常用于低盐浓度下沉淀蛋白质。 机理分析进展 对某些具有生物活性的大分子容易引起变性失活，操作需在低温下进行。成本高。 优点 缺点 ①分辨能力比盐析法高，即一种蛋白质或其他溶质只在一个比较窄的有机溶剂浓度范围内沉淀。 ②沉淀不用脱盐，过滤比较容易（如有必要，可用透析袋脱有机溶剂）。 2、有机溶剂的选择和浓度的计算 不同有机溶剂沉淀蛋白质的效率受多方面的影响，需通过试验加以选择。大致上以丙酮最佳，乙醇次之，甲醇更次。 前提：能与水互溶 V = 需加入100％浓度有机溶剂的体积 V0 = 原溶液体积 S1 = 原溶液中有机溶剂的浓度 S2 = 所要求达到的有机溶剂的浓度 离子强度 3、有机溶剂沉淀的影响因素 温度 样品浓度 pH值 有机溶剂必须预先冷至较低温度，操作要在冰盐浴中进行，加入有机溶剂时必须缓慢且不断搅拌以免局部过浓 通常使用5mg/mL～20mg/mL的蛋白质初浓度 样品稳定的pH值范围内，等电点附近 通常溶液中盐浓度以不超过5％为宜 四、非离子多聚物沉淀法 20世纪60年代非离子型聚合物开始用于分离血纤维蛋白原和免疫球蛋白，从此高相对分子质量非离子聚合物沉淀蛋白质的方法被广泛使用，如：聚乙二醇（PEG）、聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、葡聚糖等。 ①沉淀作用是聚合物与生物大分子发生共沉淀作用。 ②由于聚合物有较强的亲水性，使生物大分子脱水而发生沉淀。 ③聚合物与生物大分子之间以氢键相互作用形成复合物，在重力作用下形成沉淀析出。 ④通过空间位置排斥，使