第三章微生物菌种.pptVIP

三、微生物菌种的保藏 微生物菌种是珍贵的自然资源，是从事微生物学以及生命科学研究的基本材料，特别是利用微生物进行有关生产如抗生素、氨基酸、酿造等工业，更离不开菌种。所以菌种保藏是进行微生物学研究和微生物育种工作的重要组成部分。 目的： ①使菌体在一定时间内不死亡 ②不被其他微生物污染 ③不会因发生变异而丢失重要的生物学性状 措施：低温、干燥、缺氧、避光、缺乏营养、添加保护剂等，令菌株的代谢水平降低，乃至完全停止，达到半休眠或完全休眠的状态，抑制其繁殖能力。 一种好的保藏方法首先应能长期保持菌种原有的优良性状不变，同时还需考虑到方法本身的简便和经济，以便生产上能推广使用。 1 定期移植保藏法（斜面，液体，半固体 ） 定期：3～6个月，4～6℃ 优点： ①操作简单，不需特殊设备 ②使用方便 ③便于观察 缺点： ①保藏时间短，只有3～6个月 ②经过反复传代，易发生变异 范围：适用于各类微生物保藏 长期传代十分繁琐，容易污染，特别是自发突变导致菌种衰退，使菌株的形态、生理特性、代谢物产量等发生变化。除了采用传代法，还必须根据条件采用其它方法。 2 石蜡油封藏法 小斜面培养基试管→ 接种→ 石蜡油处理（石蜡灭菌，121℃，30min，然后置于170℃干燥1h）→ 取冷却的石蜡油注入小斜面试管中，液面高于培养基约1cm→ 直立放入4℃保藏 优点： ①可防止水分蒸发、传代细菌的干燥死亡 ②限制氧的供应，抑制代谢 ③操作简单，不需特殊的仪器设备 ④保藏时间长，1～10年 缺点：须直立放置，所占位置较大，不便携带 范围：适用于酵母、芽孢杆菌、某些丝状真菌，能同化烃类的微生物则不宜 3 砂土管保藏法 ①取砂→ 过筛（40~60目）→ 10％盐酸浸泡24h，水洗至中性→ 烘干 ②取土→ 过筛（100目）→ 土：砂以1：2混合，分装在安瓿管内，每管1g左右，加塞 ③灭菌，121℃，30～60min，3次 ④无菌检查：1支/10支，若有微生物生长则需重新灭菌 ⑤菌种斜面注入2～3 ml无菌水，将菌苔刮下，制成菌悬液 ⑥取0.5ml菌悬液，放入砂土管中，混合 ⑦将砂土管放入真空干燥器内抽真空，4~6h，砂土成粉末状 ⑧熔封，放在4℃保藏 优点：①真空干燥，彻底隔绝水分、空气 ②简单方便 ③保藏时间长，1～10年 缺点：只适于产孢子微生物（芽孢细菌、放线菌、霉菌） 4 冷冻真空干燥保藏法 ①准备安瓿管：2％盐酸浸泡，水洗至中性，烘干，标签，加塞，121℃，灭菌30min ②准备保护剂：20％脱脂奶粉（蒸馏水溶解），灭菌：116℃，15~20min。随机取几份无菌检查，确认无菌后方可使用 ③制菌悬液：斜面试管加入保护剂2～3ml，振荡，混匀 ④分装样品：每管加菌悬液约0.2ml。加蒸馏水作对照 ⑤冷冻， -36~ -45℃，呈固态 用程序控制降温仪进行分级降温： 室温 → 4℃ (快速) 4℃ → -40℃（降1 ℃/min ） -40℃ → -60℃（降5 ℃/min ） 或者： 室温→4℃（冰箱）→-18℃（冰箱）→-30℃（低温冰箱或冷柜）→-70℃（超低温冰箱） ⑥抽真空： 0.02~0.01mmHg 要求含水量1-3%， 判断：样品表面有裂痕； 样品与冻干管内壁有脱落现象； 对照管完全干燥 ⑦检测：高频电火花仪（灰蓝色电光：真空度好） ⑧熔封：火焰熔封 ⑨4℃或室温保藏（前者为宜） 优点： ①可长期保存（10年以上） ②适用于大多数微生物 缺点：设备要求复杂 范围：适用于各类微生物，细菌、放线菌、霉菌、病毒，但不适用于在斜面培养基上不产孢子只产菌丝的担子菌（如香菇、木耳） 5 液氮超低温保藏法（最先进） ① 安瓿管：能经受温度变化121 ℃ ～ -196 ℃ ，洗净，烘干，121 ℃灭菌30 min ② 准备保护剂：10％ ～20％甘油， 121 ℃30 min，随机抽样无菌检查 ③制菌悬液：同前 ④分装：用记号笔标注安瓿管，每管加菌悬液约0.5ml，拧紧螺旋帽 ⑤预冻：4℃（30 min ）→-18℃（ 20～ 30 min ）→-30℃（ 20 min ）→-70℃（ 1h ） ⑥保藏：液氮罐液相 －196℃（气相－150℃） ⑦恢复：37℃水浴中振荡1～2 min至全部融化 优点： ①适用于所有微生物 ②可长期保存（20年以上） ③操作方便 缺点： 设备要求复杂，成本高 范围： 适用于所有微生物 注意： 密封安瓿管十分重要。如果液氮罐中液氮