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2025年免疫学实验操作与技能考核及答案解析

免疫学实验操作与技能考核（2025年）

一、操作考核部分（总分60分）

实验1：双抗体夹心法ELISA检测人血清IL-6浓度（20分）

操作要求：使用商品化ELISA试剂盒，完成从样本处理到结果判读的全流程操作，记录关键参数并分析可能误差来源。

操作步骤与评分标准：

1.试剂准备（3分）：

-取出试剂盒（含包被抗IL-6单抗的96孔板、标准品、检测抗体、HRP标记二抗、TMB显色液、终止液、洗涤液），平衡至室温（25℃±2℃）。

-标准品稀释：将1000pg/ml的标准品用样本稀释液倍比稀释为500、250、125、62.5、31.25、15.625pg/ml（共6个梯度），空白孔加样本稀释液。

-评分点：标准品稀释顺序（从高到低）、移液枪量程选择（10-100μl用单道，多道需校准）、标记清晰（每孔标注浓度或样本编号）。

2.加样与孵育（5分）：

-每孔加100μl标准品或稀释后的血清样本（1:50稀释，避免高浓度样本钩状效应），空白孔不加。

-封板膜密封，37℃孵育90分钟（±5分钟），避免孔内液体蒸发（需在孵育箱内放置湿盒）。

-评分点：加样量准确性（允许误差≤5%）、孵育时间控制（超时或不足会影响抗原抗体结合平衡）、封板膜贴合度（气泡会导致局部温度不均）。

3.洗涤（4分）：

-弃去孔内液体，每孔加满洗涤液（300μl），静置30秒后拍干，重复5次（严格按试剂盒要求，部分试剂盒要求3次）。

-最后一次拍干后倒置30秒，避免残留洗涤液稀释后续试剂。

-评分点：洗涤次数（不足易导致非特异性结合，背景升高）、拍干力度（过猛可能破坏包被抗体）、残留液体积（≤10μl）。

4.加检测抗体与二抗（4分）：

-每孔加100μl生物素标记的检测抗体（工作浓度1μg/ml），37℃孵育60分钟；洗涤5次后，加100μlHRP-链霉亲和素（1:2000稀释），37℃孵育30分钟。

-评分点：检测抗体与二抗的稀释准确性（需用试剂盒提供的稀释液，避免用PBS导致离子强度变化）、孵育时间（二抗孵育过久可能增加非特异性结合）。

5.显色与终止（3分）：

-每孔加100μlTMB显色液（避光保存），37℃避光孵育15分钟（显色时间需严格控制，过长可能导致过饱和）。

-加入50μl终止液（2MH2SO4），10分钟内用酶标仪读取450nm吸光度（A450）。

-评分点：显色时间（需观察颜色变化，浅蓝即可终止，避免深蓝后读数误差）、终止液加入顺序（从左到右，避免孔间时间差）、读数时间（超过30分钟可能因TMB氧化导致吸光度漂移）。

6.结果分析（1分）：

-以标准品浓度为横坐标，A450为纵坐标，绘制四参数逻辑曲线（4-PL），计算样本IL-6浓度。

-评分点：标准曲线R2≥0.99（若＜0.98需检查稀释或孵育问题）、样本浓度在标准曲线线性范围内（若超出需重新稀释）。

常见误差与解析：

-背景过高：可能因洗涤不彻底（残留血清蛋白与二抗结合）或封闭不足（包被孔未结合位点被检测抗体非特异性占据，需确认试剂盒是否已预封闭）。

-标准曲线平台期提前：可能因包被抗体浓度过高（固相抗原过量，高浓度标准品无法继续结合），或孵育时间过长（结合达到饱和）。

实验2：流式细胞术检测外周血T细胞亚群（CD3+CD4+、CD3+CD8+）（20分）

操作要求：使用全血样本，完成红细胞裂解、抗体标记、仪器调试及数据采集，分析CD4/CD8比值。

操作步骤与评分标准：

1.样本处理（4分）：

-取200μlEDTA抗凝全血，加入流式管，每管加5μlCD3-APC、5μlCD4-FITC、5μlCD8-PE（抗体工作浓度需预实验优化，避免过量导致非特异性结合）。

-避光室温孵育20分钟（避免4℃导致Fc受体介导的非特异性结合）。

-加2ml红细胞裂解液（NH4Cl-Tris缓冲液，pH7.4），室温避光10分钟至液体澄清，1500rpm离心5分钟，弃上清，PBS洗2次（去除裂解液残留）。

-评分点：抗体体积准确性（需用校准后的微量移液器）、裂解时间（过长可能损伤白细胞膜表面抗原）、离心速度（过高可能导致细胞破碎）。

2.仪器调试（5分）：

-开机预热30分钟，校准液（如BDCSTbeads）调整电压，确保FSC（前向散射，反映细胞大小）、SSC（侧向散射，反映细胞内颗粒度）信