第三章细胞生物学研究方法.pptVIP

第三章细胞生物学研究方法第一节细胞形态结构的观察方法第二节细胞组分的分析方法第三节细胞培养、细胞工程与显微操作技术第一页，共一百零二页。

第一节细胞形态结构的观察方法一、光学显微镜技术(lightmicroscopy) 二、电子显微镜技术(Electromicroscopy) 三、扫描遂道显微镜(Scanningtunnelingmicroscope,STM)第二页，共一百零二页。

电子显微镜扫描隧道显微镜光学显微镜0.1nm1nm10nm100nm1μm100μm1mm1cm10μm第三页，共一百零二页。

(一)普通复式光学显微镜技术一、光学显微镜技术光学显微镜的组成部分：①照明系统，包括光源和聚光器；②光学放大系统，由物镜和目镜组成③机械装置，用于固定材料和观察方便。第四页，共一百零二页。

光镜样本制作:经过固定剂因定、包埋、5μm薄切片、观察常用的固定剂：甲醛等常用的包埋剂：石蜡分辨率：指区分开两个质点间的最小距离。最大分辩率：0.2μm第五页，共一百零二页。

第六页，共一百零二页。

（二）相差和微分干涉显微镜技术相差显微镜（phasecontrastmicroscope）：1932年P．Zernike发明，1953年,诺贝尔物理奖。最大特点：可以观察未经染色的标本和活细胞。基本原理：把透过标本的可见光的光程差变成振幅差，从而提高了各种结构间的对比度，使各种结构变得清晰可见。第七页，共一百零二页。

?相差显微镜与普通光学显微镜不同之处：1.环形光阑(annular?diaphragm):位于光源与聚光器之间。作用:使透过聚光器的光线形成空心光锥,焦聚到标本上。2.相位板(annularphaseplate):在物镜中加涂有氟化镁的相位板，将直射光或衍射光的相位推迟1/4λ。A+相板：将直射光推迟1/4λ，两组光波合轴后光波相加，振幅加大，标本结构比周围介质更加变亮，形成亮反差（或称负反差）。B+相板：将衍射光推迟1/4λ，两组光线合轴后光波相减，振幅变小，形成暗反差（或称正反差），结构比周围介质更加变暗。第八页，共一百零二页。

微分干涉显微镜（differentialinterferencemicroscope）1952年，Nomarski发明，适于研究活细胞中较大的细胞器。优点:能显示结构的三维立体投影影像，立体感特别强，适合于显微操作(基因注入、核移植、转基因)。第九页，共一百零二页。

原理:利用两组平面偏振光的干涉，加强影像的明暗效果能显示结构的三维立体投影。标本可厚一点，折射率差别更大，故影像立体感更强。录像增差显微镜技术（video-enhancemicroscopy）计算机辅助的DIC显微镜可在高分辨率下研究活细胞中的颗粒细胞器的运动。第十页，共一百零二页。

(三)荧光显微镜技术(FluorescenceMicroscopy)原理与应用：利用较短波长的光使样品受到激火，产生较长波长的荧光，可作观察和分辩样品中产生荧光物质的成分和位置。包括：直接荧光标记技术;间接免疫荧光标记技术在光镜水平用于特异蛋白质等生物大分子的定性定位：如绿色荧光蛋白(GFP)的应用?第十一页，共一百零二页。

Singapore’sNationalInstituteofEducationUKUniversityofFloridaFrenchSingaporeSouthKorea第十二页，共一百零二页。

(四)激光共焦扫描显微镜技术（Laser

ScanningConfocalMicroscopy）?原理与应用：利用共焦光路和激光扫描技术获取生物样品不同层面的图像，再通过计算机组合成三维重构的影像。排除焦平面以外光的干扰，增强图像反差和提高分辨率(1.4—1.7倍)，可重构样品的三维结构。第十三页，共一百零二页。

二、电子显微镜技术（一）电子显微镜的基本知识（二）主要电镜制样技术（三）扫描电镜Scanningelectronmicroscope，SEMScanningprobemicroscope，SPM第十四页，共一百零二页。

（一）电子显微镜的基本知识显微镜分辨本领光源透镜真空成像原理LM200nm可见光（400-700nm）玻璃透镜不要求真空利用样品对光的吸收形成明暗反差和颜色变化TEM0.2nm电子束（0.01-0.9nm）电磁透镜1.33x10-5～1.33x10-3Pa利用样品