核酸分离和纯化.pptVIP

核酸的紫外吸收光谱超微量核酸定量仪更加方便第30页，共51页，星期日，2025年，2月5日A：测DNA：纯的DNA样品OD260/OD280=1.8（1.7~1.9）OD260/OD2302.01)OD260/OD2801.9,RNA污染。2)OD260/OD2801.6，存在蛋白质或酚污染；3)OD260/OD2302.0，溶液中有残存的盐和小分子杂质，如核苷酸、氨基酸等。注：可能出现既含蛋白质又含RNA的DNA溶液比值为1.8的情况。3.1.2紫外分光光度法分析纯度第31页，共51页，星期日，2025年，2月5日B：测RNA纯的RNA样品OD260／OD280=2.0(1.7~2.0)OD260/OD2302.01）OD260/OD280比值太小，蛋白质或酚的污染；2）OD260/OD2802.0，可能被异硫氰酸胍等污染；3）OD260/OD2302.0，表明有小分子及盐存在。第32页，共51页，星期日，2025年，2月5日3.2荧光光度法鉴定核酸3.2.1测定核酸含量：原理：DNA、RNA在荧光染料溴乙锭(EB)嵌入碱基平面之间后，DNA、RNA样品在紫外光激发下，可发出红色荧光，荧光强度与核酸含量成正比。使用一系列已知的不同浓度DNA溶液作标准对照，可比较出被测DNA溶液浓度。注意：此法的比较主要基于目测，是估计水平。常用的荧光染料还有:goldenview,gelred,sybrgreen…第33页，共51页，星期日，2025年，2月5日3.2.2荧光光度法鉴定核酸纯度原理：溴化乙锭(EB)等荧光染料示踪的核酸电泳结果。基因组DNARNA第34页，共51页，星期日，2025年，2月5日核酸鉴定实际常用操作程序核酸定量仪测定浓度，OD260/OD280及OD260/OD230比值。琼脂糖电泳，UV下观察验证纯度及判断是否降解第35页，共51页，星期日，2025年，2月5日(1)对DNA①DNA样品溶于pH8.0的TE，4℃或-20℃保存；②长期保存样品中可加入1滴氯仿。(2)对RNA①RNA样品溶于0.3mol/LNaAc(pH5.2)②可以沉淀形式贮于乙醇，可在-20℃中长期保存;③最常用无RNase水或高压后的DEPC水溶解RNA，冻贮于-70~-80℃。3.3核酸的保存TE：Tris-Cl,EDTA第36页，共51页，星期日，2025年，2月5日4、核酸提取方法简单介绍4.1基因组DNA的提取方法4.2质粒的提取和纯化4.3Trizol法提取总RNA第37页，共51页，星期日，2025年，2月5日4.1基因组DNA的提取方法4.1.1酚抽提法以含EDTA、SDS及RNase的裂解缓冲液裂解细胞，经蛋白酶K处理后，用pH8.0的Tris饱和酚抽提。（DNA）第38页，共51页，星期日，2025年，2月5日核酸分离和纯化第1页，共51页，星期日，2025年，2月5日找答案？核酸分离纯化的原则是什么？为防止核酸降解需要注意什么？核酸制备基本步骤？如何鉴定核酸浓度和纯度？核酸的保存方法有哪些？第2页，共51页，星期日，2025年，2月5日前言核酸（nucleicacid）是以核苷酸为基本组成单位的生物信息大分子。是遗传信息的携带者，是基因表达的物质基础。第3页，共51页，星期日，2025年，2月5日核酸的分类：DNA核内染色体DNA。核外也有少量DNA，如线粒体DNA，叶绿体DNA。质粒DNA。RNA存在于细胞质中，如mRNA,rRNA,tRNA等。除上述DNA，RNA外，还有非细胞形式存在的病毒和噬菌体，其或只含DNA，或只含有RNA。第4页，共51页，星期日，2025年，2月5日主要内容1.核酸分离与纯化的原则及要求2.核酸制备的基本步骤3.核酸的鉴定和保存4.核酸提取方法简介第5页，共51页，星期日，2025年，2月5日1.核酸分离与纯化的原则及要求1.1核酸分离与纯化的一般原则(1)保持核酸分子一级结构的完整性，是核酸结构和功能研究的最基本要求。(2)排除其他分子的污染，保证核酸的纯度。第6页，共51页，星期日，2025年，2月5日1.2核酸分离与纯化的要求(1)为保证核酸的完整性，（防止降解），在实