目的基因的制取新.pptVIP

CompanyLogoD化学合成法化学合成法的基本战略化学合成的单元操作DNA化学合成的用途第30页，共60页，星期日，2025年，2月5日CompanyLogo化学合成法的基本战略全基因合成化学合成目的基因的前提条件是基因的DNA序列已知，有三种战略：小片段粘接法：混合退火根据目的基因全序列，分别合成12-15bps单链DNA小片段T4-DNA连接酶连接克隆入合适的载体第31页，共60页，星期日，2025年，2月5日CompanyLogo化学合成法的基本战略全基因合成补钉延长法：混合退火根据目的基因两条互补链全序列，分别合成12-15碱基长的单链DNA小片段以及20-30碱基长的单链DNA中片段T4-DNA连接酶连接克隆入合适的载体Klenow酶聚合第32页，共60页，星期日，2025年，2月5日CompanyLogo化学合成法的基本战略全基因合成大片段酶促法：混合退火根据目的基因的全序列，分别合成40-50碱基长的单链DNA片段T4-DNA连接酶连接克隆入合适的载体Klenow酶聚合第33页，共60页，星期日，2025年，2月5日CompanyLogo化学合成法的基本战略全基因合成上述三种方法各有利弊：化学合成DNA的单片段愈短，收率就愈高，但由于化学合成的份额较大，成本较高；在大片段酶促法合成目的基因时，虽然化学合成的份额相对较小，成本较低，但大片段化学合成的收率极低，例如，每聚合一个单体的产物收率为95%则合成50个碱基长的DNA单链大片段的总收率只有7.7%第34页，共60页，星期日，2025年，2月5日CompanyLogo化学合成法的基本战略探针等寡聚核苷酸合成在某些情况下，往往只知道目的基因编码产物的部分序列，而基因序列未知，此时需要从已知的氨基酸序列推测DNA序列，然后合成探针，筛选由鸟枪法或cDNA法得到的重组子，最终获得含有目的基因的目的重组子由于大多数氨基酸拥有简并密码子，故在探针序列的设计时必须考虑下列问题：生物体对简并密码子的偏爱性，合成系列探针探针应具有足够的长度，通常在17-20个核苷酸之间探针内部不应出现可能的互补区域第35页，共60页，星期日，2025年，2月5日CompanyLogo化学合成法的基本战略探针等寡聚核苷酸合成某段连续的氨基酸序列CysMetAspGluMetLysArgAsnIle所有可能的DNA序列TGTATGGACGAAATGAAAAGAAACATACTGATGGGTTCCGACGGCGTCGC设计的简并探针序列TGTATGGACGAIATGATGTATGGATGAIATGATGCATGGACGAIATGATGCATGGATGAIATGAAG此外还可以参考各种生物体的EST数据库进行倾向性简并序列设计expressedsequencetag第36页，共60页，星期日，2025年，2月5日CompanyLogo化学合成的单元操作化学合成DNA的实质是按照序列要求将脱氧核苷酸单体一个个接上去，每接一个单体就是一个循环反应，包括：基团保护、分离、缩合、分离、去保护五大操作单元。从反应机理上来讲，DNA化学合成有磷酸二酯法、磷酸三酯法、亚磷酸液三酯法；具体操作过程又有液相合成和固相合成两种形式。前者操作繁琐，基本上已淘汰；后者反应中间物的分离程序简便，DNA合成仪就是根据固相亚磷酸液三酯法原理设计的第37页，共60页，星期日，2025年，2月5日CompanyLogoDMT：二甲氧基三苯甲基化学合成的单元操作第38页，共60页，星期日，2025年，2月5日CompanyLogoDNA化学合成的用途合成天然基因修饰改造基因设计新型基因制备探针、引物、接头如生长激素释放抑制素基因、脑啡肽基因、胰岛素基因、干扰素基因等如组织型纤溶酶原激活剂基因、尿激酶原基因等第39页，共60页，星期日，2025年，2月5日CompanyLogoE基因文库的构建基因文库的基本概念基因文库的构建程序基因组文库重组克隆的排序第40页，共60页，星期日，2025年，2月5日CompanyLogo基因文库的基本概