牛布鲁氏菌与牛分枝杆菌双重实时荧光PCR检测方法.docxVIP

ICS11.220CCSB41

团体标准

T/CVMA285—2025

牛布鲁氏菌与牛分枝杆菌双重实时荧光PCR检测方法

Detectionmethodofduplexreal-timefluorescencePCRassayforBrucellabovisandMycobacteriumbovis

2025-9-30发布2025-9-30实施

中国兽医协会发布

T/CVMA285—2025

I

前言

本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。

请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。

本文件由中国兽医协会提出并归口。

本文件起草单位：中国动物疫病预防控制中心、青海省动物疫病预防控制中心、广西壮族自治区动物疫病预防控制中心、北京亿森宝生物科技有限公司、新疆生产建设兵团动物疫病预防控制中心、娄底市动物疫病预防控制中心、江苏省动物疫病预防控制中心、确山县畜牧技术服务中心、开封市动物疫病预防控制中心。

本文件主要起草人：孙雨、胡冬梅、李琦、宋晓晖、于宁卫、孙航、李晓霞、司国辉、邢薿文、邹联斌、阚威、李静、郑思思、林元清、王新杰、孙晓明、高姗姗、袁晓涛、徐鹏、闫新博、郑辉、王斯、张旭、剡文亮、刘洁琼、苏贵成、吴镜、谭庆辉、丁朝阳、王建、柴旭斓、王贞贞、谢军伟。

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牛布鲁氏菌与牛分枝杆菌双重实时荧光PCR检测方法

1范围

本文件规定了牛布鲁氏菌与牛分枝杆菌双重实时荧光PCR检测方法的原理、试剂材料、仪器用具、样品采集处理和运输保存、样本提取、试剂制备、加样和结果判定等。

本文件适用于牛布鲁氏菌与牛分枝杆菌的特异性核酸检测。

2规范性引用文件

下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其必威体育精装版版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法

GB19489实验室生物安全通用要求

NY/T541兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范

3术语和定义

本文件没有需要界定的术语和定义。

4缩略语

下列缩略语适用于本文件。

实时荧光PCR：实时荧光聚合酶链式反应（Real-timepolymerasechainreaction）

BHQ：无荧光淬灭基团（Blackholequencher）

bp：碱基对（Basepair）

Bru：牛布鲁氏菌（Brucellabovis）

Ct值：每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值所经历的循环数（Cyclethreshold）

DNA：脱氧核糖核酸（Deoxyribonucleicacid）

FAM：6-羧基荧光素（6-carboxyfluorescein）

Mtb：牛分枝杆菌（Mycobacteriumbovis）

5试剂材料

5.1试剂

5.1.1除另有规定外，所有试剂均为分析纯，实验用水应符合GB/T6682中相关规定。

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5.1.20.5mol/L乙二铵四乙酸二钠（pH8.0）、50%甘油生理盐水、0.01mol/L磷酸缓冲液（pH7.6）、4%氢氧化钠、柠檬酸钠－磷酸缓冲液、4%硫酸溶液，配方见附录A。

5.1.3曲拉通100。

5.1.4DNA提取相关试剂见附录A或其他等效商品化核酸提取试剂。

5.1.5实时荧光PCR检测试剂为商品化试剂。

5.2阳性对照

含有牛布鲁氏菌靶基因片段（参考序列见附录B.1）、牛分枝杆菌靶基因片段（参考序列见附录B.2）其阳性对照按照附录B.3制备。

5.3阴性对照

按照附录B.4制备。

5.4引物和探针序列

引物和探针序列见附录B。

6仪器设备

高速冷冻离心机、电子天平、荧光PCR仪、-20℃低温冰箱、pH计、磁力搅拌器、恒温水浴锅、高压灭菌锅、超净工作台、可调移液器（2.5μL，10μL，20μL，100μL，200μL，1000μL）和各规格移液器枪头、离心管、研钵等。

7样品的采集和运输保存

7.1样品的采集和处理要求

样品采集和处理应符合NY/T541的要求。

7.2样本的采集

7.2.1全血样品

进行尾部静脉无菌采血。采