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2025年pcr核酸检测员题库及答案

一、PCR核酸检测基础知识

1.问题：PCR技术的基本原理是什么？其三个核心反应步骤的温度和时间范围分别是多少？

答案：PCR（聚合酶链式反应）是通过酶促反应在体外扩增特定DNA片段的技术，基于DNA双链的变性、引物与模板的退火（复性）、引物延伸三个步骤循环进行。三个核心步骤为：（1）变性：94-98℃，20-30秒，使双链DNA解旋为单链；（2）退火：50-65℃，20-40秒，引物与单链模板特异性结合；（3）延伸：70-75℃，30秒至数分钟（根据扩增片段长度调整），TaqDNA聚合酶以dNTP为原料，沿模板延伸合成新的DNA链。

2.问题：荧光定量PCR（qPCR）中常用的荧光标记技术有哪两类？各自的原理和优缺点是什么？

答案：常用荧光标记技术分为非特异性荧光染料法和特异性探针法。（1）非特异性染料法（如SYBRGreenI）：染料能与所有双链DNA结合并发出荧光，通过检测扩增过程中荧光信号的累积实时监测产物量。优点是成本低、操作简单；缺点是可能与引物二聚体或非特异性扩增产物结合，导致假阳性。（2）特异性探针法（如TaqMan探针、分子信标）：探针为标记荧光基团和淬灭基团的寡核苷酸，仅与目标序列互补结合。扩增时Taq酶的5→3外切酶活性切割探针，使荧光基团与淬灭基团分离，释放荧光信号。优点是特异性高，可区分同源序列；缺点是成本较高，需针对目标序列设计探针。

3.问题：PCR反应体系中Mg2?的作用是什么？浓度过高或过低会对实验结果产生哪些影响？

答案：Mg2?是TaqDNA聚合酶的激活剂，参与酶的催化反应，并影响引物与模板的结合效率、产物的特异性及扩增效率。Mg2?浓度过低时，酶活性降低，扩增效率下降甚至无产物；浓度过高时，会增强引物与模板的非特异性结合，导致非特异性扩增（如引物二聚体），同时可能抑制酶活性，影响实验准确性。

二、核酸检测操作流程

4.问题：新冠病毒核酸检测中，咽拭子样本采集后需在多长时间内完成检测？若无法及时检测，应如何保存？

答案：咽拭子样本采集后应在2-4小时内完成检测；若需延迟检测，应于4℃保存（不超过24小时）；若需长期保存（超过24小时），应置于-70℃或以下（避免反复冻融）。运输时需使用冰袋或干冰维持低温，确保样本核酸完整性。

5.问题：磁珠法提取核酸的关键步骤包括哪些？操作中需注意哪些细节以避免核酸损失？

答案：磁珠法提取核酸的关键步骤：（1）样本裂解：加入裂解液使细胞破裂，释放核酸并与磁珠结合；（2）磁分离：通过磁力架吸附磁珠，移除上清（含杂质）；（3）洗涤：用洗涤液去除蛋白质、盐离子等残留杂质；（4）洗脱：加入洗脱缓冲液（低盐或去离子水），使核酸从磁珠上解离。操作细节：（1）裂解时间需充分（通常5-10分钟），确保核酸完全释放；（2）磁分离时需等待磁珠完全吸附（约1-2分钟），避免吸走磁珠导致核酸损失；（3）洗涤时避免触碰磁珠，洗涤后需彻底移除残留洗涤液（残留乙醇会抑制后续PCR反应）；（4）洗脱时需将磁珠充分悬浮，洗脱时间不少于2分钟（56℃温浴可提高洗脱效率）。

6.问题：配制PCR反应体系时，为何需要在冰上操作？加样顺序通常遵循什么原则？

答案：在冰上操作可降低Taq酶活性（低温下酶活性被抑制），避免在体系配制过程中因室温升高导致非特异性扩增（如引物二聚体形成）。加样顺序通常遵循“先无核酸成分，后含核酸成分”的原则，即先加缓冲液、dNTP、引物、探针、酶等，最后加入模板核酸。此顺序可减少模板核酸暴露于室温的时间，降低污染风险，同时避免酶在未完全混合时提前反应。

三、质量控制与结果判读

7.问题：PCR实验室室内质控应包含哪些指标？阴性对照和阳性对照的作用分别是什么？

答案：室内质控指标包括：（1）阴性对照：无扩增曲线（Ct值无）；（2）阳性对照：Ct值在预期范围内（通常≤30）；（3）内标（若使用）：Ct值稳定（变异系数≤5%）；（4）扩增效率：90%-110%（通过标准曲线斜率计算）；（5）重复性：同一样本重复检测Ct值差异≤1.0。阴性对照用于监测实验过程中是否存在污染（如试剂、环境中的核酸污染），若阴性对照出现扩增，说明存在污染，实验结果无效。阳性对照用于验证试剂有效性和操作正确性，若阳性对照无扩增或Ct值异常，提示试剂失效或操作失误。

8.问题：荧光定量PCR结果判读中，“灰区”样本（如Ct值38-40）应如何处理？

答案：灰区样本需进行重复检测：（1）重新提取原样本核酸，使用同一批号试剂再次检测；（2）若重复检测Ct值仍≤40且扩增曲线符合要求（指数增长期明显、熔解曲线单一峰），判为阳性；（3）若重复检测无扩增或Ct值40，判为阴性；（4