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淋巴细胞亚群检测操作规范

一、总则

1.1目的

为规范淋巴细胞亚群检测的操作流程，确保检测结果的准确性、可靠性和重复性，为临床诊断、治疗监测和预后评估提供科学依据，特制定本规范。

1.2适用范围

本规范适用于临床实验室采用流式细胞术进行的外周血淋巴细胞亚群检测。其他样本类型（如脑脊液、胸腹水等）的检测可参照本规范，并根据实际情况进行适当调整。

1.3规范性引用文件

本规范制定过程中，参考了国家相关法律法规、行业标准及技术指南，包括但不限于《临床实验室管理办法》、《流式细胞术检测外周血淋巴细胞亚群指南》等。

二、样本采集、处理与保存

2.1样本类型

外周静脉血。

2.2采集容器

使用含EDTA-K?或肝素钠抗凝剂的真空采血管。采血前需核对采血管标签信息，确保抗凝剂类型正确且在有效期内。

2.3采集要求

采集人员需严格无菌操作，采集静脉血约2-5ml，轻轻颠倒混匀，避免剧烈震荡导致细胞损伤或凝血。

2.4样本运输与保存

1.采集后的样本应在室温（18-25℃）下尽快送检，理想情况下应在采集后4小时内完成检测。

2.若无法及时检测，样本可短期保存于2-8℃冰箱，但保存时间不应超过24小时。冷藏样本检测前需恢复至室温，并充分混匀。

3.样本运输过程中应避免极端温度（如冷冻、高温）和剧烈震动。

2.5样本接收与拒收标准

1.实验室接收样本时，需核对样本标识、采集时间、抗凝剂类型、样本量及外观（有无凝块、溶血、脂血等）。

2.符合以下情况之一的样本应拒收：标签不清或错误；抗凝剂错误或失效；样本严重溶血、脂血或凝块；采集时间超过规定时限且未按要求冷藏；样本量不足。

三、实验操作步骤

3.1试剂与材料准备

1.主要试剂：荧光标记的单克隆抗体组合（如CD3/CD4/CD8/CD19/CD16+56等，根据检测项目选择）、红细胞裂解液、洗涤缓冲液（如PBS含0.5-1%牛血清白蛋白和0.05%叠氮钠）、固定液（如1%多聚甲醛PBS溶液，可选）。

2.试剂储存与复温：所有试剂应按照说明书要求避光储存于规定温度。检测前，将所需试剂从冰箱取出，平衡至室温。抗体应避免反复冻融，建议分装保存。

3.实验材料：流式专用试管、微量加样器及配套吸头、离心机、涡旋混匀器、恒温水浴箱或孵育器。

3.2样本制备（全血裂解法示例）

1.标记抗体：取流式专用试管，根据实验设计标记管号。分别加入适量（按抗体说明书推荐体积）的荧光标记抗体组合至相应试管中。

2.加样：向各试管中加入充分混匀的抗凝全血样本（通常为50μl，具体体积根据抗体说明书优化）。轻轻混匀，避免产生气泡。

3.避光孵育：室温（或按说明书推荐温度）避光孵育一定时间（通常15-30分钟）。孵育期间避免光照和剧烈晃动。

4.红细胞裂解：孵育结束后，向各试管中加入预冷或室温的红细胞裂解液（通常为1-2ml），轻轻混匀，室温避光裂解一定时间（通常5-10分钟）。裂解时间和温度需严格控制，避免白细胞损伤。

5.洗涤：裂解完成后，以适当离心力（通常300-400×g）离心5-10分钟，弃上清。加入适量洗涤缓冲液（如2ml），涡旋混匀重悬细胞，再次离心洗涤。弃上清。

6.固定（可选）：若不立即上机，可加入适量固定液（如0.5ml）重悬细胞，4℃避光保存，24小时内完成检测。若立即上机，可加入适量洗涤缓冲液重悬细胞。

3.3上机前准备

1.样本上机前需涡旋混匀，如有明显细胞团块，可通过300目尼龙网过滤或轻轻吹打分散。

2.准备好流式细胞仪，开机预热，进行光路校准和荧光补偿调节（建议使用补偿微球或已知阳性样本）。

四、流式细胞仪检测

4.1仪器启动与校准

1.严格按照仪器操作规程启动流式细胞仪，进行必要的日常维护（如清洁流动室）。

2.使用标准荧光微球进行仪器的光路对准、PMT电压校准和灵敏度验证。确保仪器处于最佳工作状态。

4.2质控品检测

每批次实验应包含适当的质控品（如商品化全血质控品或实验室内部质控品），与待检样本同步处理和检测，以监控整个实验过程的稳定性。

4.3样本检测

1.将制备好的样本管放入流式细胞仪样品台，选择对应的检测方案和模板。

2.设门策略：根据检测的淋巴细胞亚群种类，采用合适的设门策略。通常首先通过FSC/SSC设门获取淋巴细胞群，然后根据荧光标记抗体组合，依次设门分析各亚群比例及绝对计数（若配备绝对计数管或beads）。

3.数据采集：对于每一样本，确保采集足够数量的淋巴细胞events（通常至少10,000个淋巴细胞，具体根据亚群稀有程度调整）。记录样本信息和获取数据。

4.检测过程中，定期检测鞘液和废液水平，及时更换。

五、数据分析

5.1软件启动与数据导入

打开流式数据分