TSATA010—2019冰鲜鳕鱼产品中易与鳕鱼混淆物种检测——实时荧光PCR法.docxVIP

ICS67.050

X04

团 体 标准

T/SATA010—2019

冰鲜鳕鱼产品中易与鳕鱼混淆物种检测

——实时荧光PCR法

Real-timePCRDetectionMethodforCodFishMixupSpeciesinFreshandFrozenProducts

2019-03-11发布 2019-04-11实施

深圳市分析测试协会 发布

T/SATA

T/SATA010—2019

PAGE\*ROMAN

PAGE\*ROMANII

目 次

前 言 Ⅱ

范围 1

规范性引用文件 1

原理 1

试剂和材料 1

仪器和设备 2

分析步骤 2

结果判断与表述 3

防污染措施 3

方法检出限 4

附录A（资料性附录）DNA提取试剂盒组成、操作步骤 5

前 言

本标准按照GB/T1.1给出的规则起草。本标准由深圳市分析测试协会归口。

本标准主要起草单位：深圳市计量质量检测研究院。

本标准主要起草人：林霖、王坤、吴佳辉、张世伟、朱成杰、余灏、陈国培、赖心田、杨国武。本标准为首次发布。

T/SATA

T/SATA010—2019

PAGE

PAGE5

冰鲜鳕鱼产品中易混淆物种检测实时荧光PCR法

范围

本方法规定了鳕鱼及其制品中易混淆物种裸盖鱼（Anoplopomafimbria）、油鱼（Lepidocybiumflavobrunneum，Ruvettuspretiosus）和南极犬牙鱼（Dissostichuseleginoides，Dissostichusmawsoni）DNA成分的实时荧光PCR检测方法。

本方法适用于鳕鱼、鳕鱼片、鳕鱼扒等冰鲜鳕鱼产品中裸盖鱼、油鱼和南极犬牙鱼DNA成分的定性检测。

规范性引用文件

下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其必威体育精装版版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB/T6682 分析实验室用水规格和试验方法

GB/T27403 实验室质量控制规范食品分子生物学检测

原理

使用商业化DNA提取试剂盒，获得适用于实时荧光PCR检测的DNA。分别使用裸盖鱼、油鱼或南极犬牙鱼特异性引物探针，通过实时荧光PCR反应，获得Ct值，根据Ct值判断样品是否检出裸盖鱼、油鱼或南极犬牙鱼DNA成分。

试剂和材料

除另有规定外，本方法中所用试剂均为分析纯，水为符合GB/T6682的一级水。所有试剂均用无DNA

酶污染的容器分装。

引物及探针序列

裸盖鱼DNA成分NADH2基因

裸盖鱼源成分5’端引物：5’-AGGGACCACCCTAACATTCG-3’

裸盖鱼DNA成分3’端引物：5’-GTGGGTGGTGATGCTGTGCT-3’

裸盖鱼DNA成分探针：5’-FAM-CAGCTCTCACTGACTACTCGCATGA-BHQ1-3’

油鱼DNA成分Cytb基因

油鱼DNA成分5’端引物：5’-TAACTTCGGATGACTCATCCG-3’

油鱼DNA成分3’端引物：5’-AGTAAAGGCCTCGTCCAATGT-3’

油鱼DNA成分探针：5’-FAM-CATCCGAAACCTTCATGCAAACGGC-BHQ1-3’

南极犬牙鱼DNA成分CK基因

南极犬牙鱼DNA成分5’端引物：5’-CTGAATATGTAGGTGCATACG-3’

南极犬牙鱼DNA成分3’端引物：5’-TTGCTCTTTGTGTTTCGGTT-3’

南极犬牙鱼DNA成分探针：5’-FAM-TCCATTAGGTAAGCGAGCGGGAAGA-BHQ1-3’

真核生物18SrRNA内参照基因

内参照5’端引物：5’-TCTGCCCTATCAACTTTCGATGGTA-3’

内参照3’端引物：5’-AATTTGCGCGCCTGCTGCCTTCCTT-3’

内参照探针：5’-FAM-CCGTTTCTCAGGCTCCCTCTCCGGAATCGAAC-BHQ1-3’

商业化DNA提取试剂盒。

商业化PCR反应预混液。

仪器和设备

实时荧光PCR仪。

微量紫外分光光度计。

恒温水浴锅或恒温混匀仪或金属干浴器。

高速冷冻离心机：离心力18,000g以上。

微量移液器（0.5μL-10μL，10μL-100μL，20μL-200μL，100μL-1000μL）。

涡旋振荡器。

天平：感量0.001g。

分析步骤

样品前处理

样品只有单块鱼肉组成：使用灭菌剪刀适量剪取中心部