TSATA011—2019肉类食品中家鸭番鸭DNA成分检测——实时荧光PCR法.docxVIP

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X04

团 体 标准

T/SATA011—2019

2019-03-11

2019-03-11发布

2019-04-11实施

肉类食品中家鸭、番鸭DNA成分检测

——实时荧光PCR法

Real-timePCRDetctionMethodfor

AnasplatyrhynchosdomesticaandCairinamoschataDNAIngredientsinMeatProduct

深圳市分析测试协会 发布

T/SATA

T/SATA011—2019

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目 次

前 言 Ⅱ

范围 1

规范性引用文件 1

原理 1

试剂和材料 1

仪器和设备 1

分析步骤 2

结果判断与表述 2

防污染措施 3

方法检出限 3

附录A（资料性附录）DNA提取试剂盒组成、操作步骤 4

前 言

本标准按照GB/T1.1给出的规则起草。本标准由深圳市分析测试协会归口。

本标准主要起草单位：深圳市计量质量检测研究院。

本标准主要起草人：林霖、陈国培、吴佳辉、张世伟、王坤、朱成杰、余灏、赖心田、杨国武。本标准为首次发布。

T/SATA

T/SATA011—2019

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食品中家鸭、番鸭DNA成分检测实时荧光PCR法

范围

本方法适用于食品中家鸭（Anasplatyrhynchosdomestica）和番鸭（Cairinamoschata）DNA成分的实时荧光PCR检测方法。

规范性引用文件

下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其必威体育精装版版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB/T6682 分析实验室用水规格和试验方法

GB/T27403 实验室质量控制规范食品分子生物学检测

原理

使用商业化DNA提取试剂盒，获得适用于实时荧光PCR检测的DNA。分别使用基于12SrRNA基因设计的家鸭、番鸭通用引物以及特异性探针，通过双重实时荧光PCR反应，分别获得Ct值，根据Ct值判断样品是否检出相应的DNA成分。

试剂和材料

除另有规定外，本方法中所用试剂均为分析纯，水为符合GB/T6682的一级水。所有试剂均用无DNA

酶污染的容器分装。

通用引物序列

’端引物：5’-ACGTACATACCGCCCGTCA-3’

3’端引物：5’-ATTCTAAGTACACCTTCCGGT-3’

特异性探针序列

家鸭DNA成分探针：5’-FAM-ACATAATTAATACCACGTAAATGCCAA-BHQ1-3’

番鸭DNA成分探针：5’-CY5-ACATAACTAATACCCTAAACATGCCAA-BHQ1-3’

注：荧光标记基团及淬灭基团可根据所使用的仪器设备调整，应选择无交叉信号的两种荧光基团。

商业化DNA提取试剂盒。

商业化PCR反应预混液。

仪器和设备

实时荧光PCR仪。

微量紫外分光光度计。

恒温水浴锅或恒温混匀仪或金属干浴器。

高速冷冻离心机：离心力18,000g以上。

样品粉碎机

微量移液器（0.5μL-10μL，10μL-100μL，20μL-200μL，100μL-1000μL）。

涡旋振荡器。

天平：感量0.001g。

分析步骤

样品前处理

样品经粉样破碎处理后进行DNA提取步骤。

DNA提取

按照商业化DNA提取试剂盒说明书中要求的取样量称取样品，后每个样品设置两个平行，若有调味料应使用灭菌去离子水洗涤后去除上清液，按照商业化DNA提取试剂盒说明书操作。

注：试剂盒信息可参考附录A，或使用其他等效试剂盒。

DNA浓度测定

取1μLDNA溶液，使用微量紫外分光光度计按照dsDNA（双链DNA）计算方式检测其浓度。

实时荧光PCR扩增

实时荧光PCR反应体系见表1。

表1实时荧光PCR反应体系

PCR预混液（2×）

10μL

10μmol/L上游引物

0.4μL

10μmol/L下游引物

0.4μL

10μmol/L探针（家鸭番鸭探针混合）

0.2μL

DNA

20-50ng

灭菌去离子水

补充至总体积20μL

PCR反应程序：95℃15s；95℃5s，60℃34s（读取荧光），40个循环。

实验对照

分别设置阳性对照、阴性对照、PCR空白对照、空白提取对照各一个。以相应物种提取的DNA为阳性对照，以已知不含相应物种提取的DNA为阴性对照，以灭菌去离子水替代DNA加入实时荧光PCR