第二章 基因工程的工具酶.pptVIP

LOGO第一节限制性核酸内切酶一.限制性内切酶的发现HamiltonO.Smith1968年，Smith等人首先从流感嗜血杆菌d株中分离出HindII和HindIII。1978年获得诺奖。此前（20世纪50年代），研究人员在噬菌体感染大肠杆菌试验中发现了寄主细胞的限制和修饰现象（R/M体系）。第2页，共37页，星期日，2025年，2月5日二.寄主的限制和修饰现象第3页，共37页，星期日，2025年，2月5日限制(Restriction)：指一定类型的细菌可以通过限制性内切酶的作用，破坏入侵的噬菌体DNA，导致噬菌体的寄主幅度受到限制。限制作用:实际就是限制性内切酶降解外源DNA，维护宿主遗传稳定的保护机制。第4页，共37页，星期日，2025年，2月5日修饰(modification)：指寄主本身的DNA，由于在合成后通过甲基化酶的作用得以甲基化，使DNA得以修饰,从而免遭自身限制性酶的破坏。修饰作用:宿主细胞通过甲基化作用达到识别自身遗传物质和外来遗传物质的目的。第5页，共37页，星期日，2025年，2月5日1）?菌株中有三个连锁的基因位点：hsdR、hsdM、hsdS。2）?hsdR编码限制性核酸内切酶---识别DNA分子特定位点，将双链DNA切断。（DNA分子转化细胞：受体细胞去掉hsdR基因位点）3）?hsdM编码产物是DNA甲基化酶---催化DNA分子特定位点的碱基甲基化反应。4）?hsdS表达产物的功能是---协助限制性核酸内切酶和甲基化酶，识别特殊的作用位点。三.限制和修饰作用的分子机制第6页，共37页，星期日，2025年，2月5日第7页，共37页，星期日，2025年，2月5日四.限制性核酸内切酶的概念和命名概念：一类能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列，并由此切割DNA双链结构的核酸水解酶。命名：1973年H.O.Smith和D.Nathams首次提出了命名原则，1980年Roberts在此基础上进行了系统分类：★用具有某种限制性酶有机体的属名第一个字母(大写)和种名的前两字母(小写)组成3个字母的略语作为该酶的基本名称。★如果酶是存在于特殊的菌株中，还应在第3个字母后面标注菌株名称的符号株或型(strain)。★如果一种特殊的菌株具有几个不同的限制与修饰体系，则以罗马数字表示该菌株中发现某种酶的先后次序。第8页，共37页，星期日，2025年，2月5日HindIII属名种名株名发现顺序HindIII嗜血流感杆菌（Haemophilusinfluenzae）d株所发现的第三个限制性内切酶。EcoRⅠ来自于EscherichiacoliRY13的第一个限制酶。举例+读法第9页，共37页，星期日，2025年，2月5日五.限制性内切酶的种类识别序列切割序列限制酶的作用模型识别序列：是一段特殊的DNA序列，该序列与其对应的限制性内切酶结合，是该酶切割DNA的前提。切割序列：识别完成后，限制性内切酶实施切割作用所在的DNA序列。第10页，共37页，星期日，2025年，2月5日Ⅰ型酶:1968年，M.Meselson和R.Yuan在E.coliB和E.coliK中分离出的核酸内切酶。特征：分子量较大，反应需Mg2+、S-腺苷甲硫氨酸（SAM）、ATP等。这类酶有特异的识别位点但没有特异的切割位点，而且切割是随机的，所以在基因工程中应用不大。由于切割的随机性，不能得到目的片段。第11页，共37页，星期日，2025年，2月5日Ⅲ型酶:这类酶可识别特定碱基序列，并在这识别位点下游的3’端24~26bp处切开DNA，所以它的切割位点也是没有特异性的。Ⅱ型酶（重点）★1970年，Smith和Wilcox在流感嗜血d株中分离出来的限制酶。★分子量通常较小，只有一种多肽，以同源二聚体的形式存在。反应只需Mg2+的存在。★特点：（1）识别位点是一个回文对称结构，并且切割位点也在这一回文对称结构上。（2）许多Ⅱ型酶切割DNA后，可在DNA上形成粘性末端，有利于DNA片段的重组。第12页，共37页，星期日，2025年，2月5日Ⅲ型酶:这类酶可识别特定碱基序列，并在这识别位点下游的3’端24~26bp处切开