动物基因组DNA的分离定量叶.pptxVIP

实验一、动物基因组DNA的分离实验目的：通过本实验了解并掌握提取基因组DNA的原理和步骤。

应保证核酸一级结构的完整性排除其它分子的污染。分离纯化核酸总的原则：核酸样品中不应存在对酶有抑制作用的有机溶剂和过高浓度的金属离子；排除其它核酸分子的污染；其它生物大分子的污染应降低到最低程度。核酸纯化应达到的要求：

01通过实验学习从动物组织中制备染色体DNA的方法。学习琼脂糖凝胶电泳，检测DNA的纯度、DNA的构型、含量以及分子量的大小。掌握DNA样品的纯化和定量检测方法。0203实验目的

组织裂解液裂解细胞:010203SDS能裂解细胞，使染色体离析，蛋白变性，释放出核酸。EDTA可抑制DNA酶的活性。NaCl;Tris·HCl;EDTA；SDS；蛋白酶K；无DNA酶的RNA酶实验原理

用蛋白酶K水解蛋白质01有机溶剂酚、氯仿抽提03氯仿加速有机相与液相分层，最后用氯仿抽提可去除核酸溶液中的迹量酚。05蛋白酶K具有广泛的切割活性，可消化细胞，降解蛋白质。02苯酚使蛋白质变性，同时抑制了DNase的降解作用。04异戊醇减少蛋白质变性操作过程中产生的气泡；有助于分相。06

01在高盐条件下，用乙醇沉淀DNA02DNA不溶于乙醇，乙醇可以沉淀DNA。03NaAc：Na+中和DNA分子上的负电荷，减少DNA分子之间的同性电荷相斥力，而易于聚集沉淀;调节PH值接近DNA等电点；04再用70%乙醇洗除沉淀中的盐分05即可获得染色体DNA

酚：氯仿：异戊醇（25：4：1）70%乙醇TEbufferRNAse琼脂糖TAE电泳缓冲液电泳设备紫外分光光度计凝胶成像系统实验材料

01匀浆缓冲液STE：02100mmol/LNaCl03mmol/LTris·HCl，pH8.004mmol/LEDTA，pH8.0。05消化缓冲液：06100mmol/LNaCl07mmol/LTris·HCl，pH8.008mmol/LEDTA，pH8.0溶液与缓冲液

0.5%SDS（临用前加）。0.1mg/mL蛋白酶K（临用前加）。无DNA酶的RNA酶(10mg/L)：将胰RNA酶溶于10mmol/LTris·HCl，pH7.5，15mmol/LNaCl溶液中，使浓度为10mg/L，于100℃水浴处理15min，以降解DNA酶，缓慢冷却到室温，－20℃保存。TE缓冲液：10mmol/LTris·HCl，pH8.01mmol/LEDTA，pH8.0平衡酚:氯仿:异戊醇＝25:24:1（体积比）。3mol/LNaAc，pH5.2：称取408gNaAc·3H2O溶于水，用3mol/L乙酸调节至pH5.2。无水乙醇。70％冷乙醇

2018材料准备012019破碎细胞或包膜－内容物释放022020核酸分离、纯化032021沉淀或吸附核酸，并去除杂质042022核酸溶解在适量缓冲液或水中05实验步骤：DNA提取

先将动物组织进行预处理：大的器官应该切成易处理的小块（1cm3）以便冻存（用液氮）及处理。任何组织都可采用，但是，如需肝脏，在杀动物之前应该禁食24h，可提高DNA的质量。收集的组织可以在－70℃下保存几年。取0.2g组织块剪碎后，加入2.0mL匀浆缓冲液，用组织匀浆器匀浆至无明显组织块存在（冰浴操作）。将组织细胞的匀浆液体转移至2.0mL离心管中，\加入蛋白酶k，轻轻反转混匀，37℃温育12～18h。温育结束前1h加RNAe至终浓度200?g/mL

加入1/10倍体积3MNaAc（pH5.2），2倍体积无水乙醇充分混匀，-20℃下15-20min。DNA沉淀用冰预冷70%乙醇洗1次，开盖37℃干燥10min（使乙醇挥发）。加入等体积酚／氯仿／异戊醇（25：4：1）等体积抽提1~3次，缓慢颠倒离心管使两相均匀混合形成乳浊液，静置3min。12000rpm，离心5分钟,扩口吸头小心吸出离心管中的上层液体，即为含DNA的水相，注意不要吸中间界面上一层厚的白色物质（蛋白质沉淀）。4℃15000rpm，离心min。根据沉淀量加入TEbuffer，37℃水浴至沉淀溶解，－20℃冰箱保存。。

如果要对提取的DNA进行完整性鉴定，可通过琼脂糖凝胶。方法是取1?l溶解的DNA样品，在0.8％的琼脂糖凝胶中进行电泳，用dured染色观察结果。取1μlDNA0.8%琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像系统记录和分析结果，估计样品DNA分子量。取10μlDNA母液稀释至1000ul，在紫外分光光度计上测A260和A280。计算样品DNA浓度，判断样品浓度和DNA纯度。

要颠倒摇动试管悬浮沉淀，不可用枪头(尤其是没剪去枪头尖端）吹打沉淀。01吸上清枪头使