生物化学检验中酶的测定.pptVIP

酶偶联反应式第30页，共77页，星期日，2025年，2月5日酶偶联反应法的基本原理在酶活性测定时，如果底物或产物不能直接测定或难于准确测定，可采用酶偶联法测定，即在反应体系中加入一个或几个工具酶，将待测酶生成的某一产物转化为新的可直接测定的产物，当加入酶的反应速度与待测酶反应速度达到平衡时，可以用指示酶的反应速度来代表待测酶的活性。第31页，共77页，星期日，2025年，2月5日第32页，共77页，星期日，2025年，2月5日酶偶联反应法的反应进程用酶偶联法测定酶活性浓度时，酶促反应进程存在四个时相：①预孵育期或预温期。②延滞期。③稳态期或恒态期。④非恒态期。第33页，共77页，星期日，2025年，2月5日酶偶联法的吸光度变化示意图第34页，共77页，星期日，2025年，2月5日注意事项应用酶偶联法测定时，关键在于确定恒态期，因为只有恒态期才能代表酶活性。只有此阶段的吸光度才会有明显线性变化。第35页，共77页，星期日，2025年，2月5日工具酶与共通反应途径第36页，共77页，星期日，2025年，2月5日工具酶在酶学分析中，作为试剂用于测定化合物浓度或酶活性浓度的酶称为工具酶。常用的工具酶有氧化还原酶类、转移酶类和水解酶类，但以氧化还原酶类更多见，因为其产物最易被直接监测而成为指示酶。第37页，共77页，星期日，2025年，2月5日第38页，共77页，星期日，2025年，2月5日共通反应途径在临床生物化学检验中，许多项目的测定往往使用有工具酶的参与的类似的反应原理，即所谓共通（或通用）反应途径。第39页，共77页，星期日，2025年，2月5日两类常用的通用反应途径NAD(P)+或NAD(P)H偶联的脱氢酶及其指示反应偶联H2O2的工具酶及其指示反应第40页，共77页，星期日，2025年，2月5日酶活性浓度的单位第41页，共77页，星期日，2025年，2月5日酶活性浓度的单位酶活性单位惯用单位，国际单位（IU），Katal单位;酶活性浓度单位酶活性浓度以每单位体积所含的酶活性单位数表示。U/L。第42页，共77页，星期日，2025年，2月5日正常上限倍数正常上限升高倍数（upperlimitsofnormal,ULN）是指把酶测定值转换为正常上限值的倍数。简单地说，就是用测得的酶活性结果除以参考范围的上限值。第43页，共77页，星期日，2025年，2月5日酶质量浓度的测定第44页，共77页，星期日，2025年，2月5日酶浓度严格来说是指酶分子的质量浓度，常以酶蛋白浓度来表示。人体体液中的酶有几百种，除LPS、LCAT、ChE、铜氧化酶（CER）外，大多数酶的含量在μg/L水平甚至更低。因此，酶活性浓度的测定是目前主要测定方法。20世纪70年代以后，随着新技术特别是免疫学技术的发展，酶的定量分析技术中出现了许多利用酶蛋白的抗原性，通过抗原抗体反应直接测定酶蛋白质量的新方法。第45页，共77页，星期日，2025年，2月5日酶蛋白浓度测定的方法国内外曾使用电泳法、柱层析法、免疫化学法等测定酶浓度，其中以免疫化学法应用较广。免疫化学法是利用酶蛋白的抗原性，制备特异性抗体后用免疫学方法测定酶浓度。第46页，共77页，星期日，2025年，2月5日酶浓度测定的免疫化学方法免疫抑制法、免疫沉淀法、放射免疫测定（RIA）、化学发光免疫测定（CLIA）、酶免疫测定（EIA）、荧光酶免疫测定（FEIA）等。其中，前两种方法可用于酶活性浓度测定，其他方法则用于酶蛋白浓度测定。例如，如免疫抑制法测定CK-MB的活性、免疫沉淀法（单向扩散法）法测定超氧化物歧化酶（SOD）的活性；RIA测定胰蛋白酶和弹性蛋白酶浓度、CLIA测定CK-MB的浓度、ELISA测定神经元特异性烯醇化酶（NSE）浓度等。第47页，共77页，星期日，2025年，2月5日CK-MB是诊断AMI、测定心肌梗塞面积的重要指标。近年来，国外对AMI诊断效率评价时多采用测定CK-MB质量，即测定CK-MB的酶蛋白质量浓度（Mass）的方法。CK-MB质量的测定通常是制备抗CK-M抗体和抗CK-B抗体或采用CK-MB抗体，用CLIA、ELISA、FEIA等方法测定。第48页，共77页，星期日，2025年，2月5日CK-MB这些方法适用于临床自动化分析，具有测定时间短（最快仅需7min）、灵敏性高（最低检测限μg/L）和准确性好的特点，明显优于其他分析测定CK-MB的方法，1990年后逐渐被广泛接受。为使CK-MB质量分析标准化，AACC成立了专门的标准化委员会，最近已研制成功采用重组基因技术的CK-MB参考材料（Rck-2）。第49页，共77页，星